腦立體定位注射技術(shù)在研究線粒體移植治療小腦神經(jīng)退行性疾病中的應用
在神經(jīng)科學領域，小腦神經(jīng)退行性疾病一直是困擾醫(yī)學界的難題。這些疾病常以小腦性共濟失調(diào)為主要表現(xiàn)，目前尚無完全糾正潛在神經(jīng)退行性病變過程的有效療法。近期第四軍醫(yī)大學王亞云教授團隊在 Nature Communications 發(fā)表題為“Mitochondria transplantation transiently rescues cerebellar neurodegeneration improving mitochondrial function and reducing mitophagy in mice”的重要研究成果，為這類疾病的治療帶來了新的曙光。
神經(jīng)退行性疾病的特征是神經(jīng)元功能進行性受損和喪失，小腦神經(jīng)退行性疾病（CBND）則表現(xiàn)為小腦性共濟失調(diào)，像共濟失調(diào)毛細血管擴張癥、脊髓小腦共濟失調(diào)等都屬于此類。線粒體功能障礙在神經(jīng)退行性疾病中扮演著關(guān)鍵角色，尤其是浦肯野細胞（PCs）中的線粒體損傷，被認為是CBND的核心發(fā)病機制之一。因此，針對PCs中線粒體的干預措施，有望成為治療CBND的有效策略。線粒體移植技術(shù)已應用于兒科心肌缺血患者，并在動物模型和細胞系研究中顯示出對神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療潛力，但它在治療CBND方面的效果和機制仍有待探索。
構(gòu)建小鼠模型，模擬疾病進程
研究人員構(gòu)建了兩種小鼠模型：一種是條件性敲除Drp1基因的小鼠（PCKO小鼠），該基因的敲除會導致PCs發(fā)生廣泛且進行性的凋亡，進而引發(fā)小腦萎縮、共濟失調(diào)等癥狀；另一種是表達TdTomato蛋白的CBND小鼠（CBNDTdTomato小鼠），用于確保實驗穩(wěn)定性并排除免疫熒光染色的干擾。通過對這些小鼠的觀察和檢測，研究人員發(fā)現(xiàn)PCKO小鼠在3個月大時，小腦萎縮明顯，PCs數(shù)量顯著減少，同時伴有運動功能障礙和神經(jīng)膠質(zhì)細胞激活。CBNDTdTomato小鼠也呈現(xiàn)出類似的PCs退化和小腦萎縮現(xiàn)象，且運動功能在1個月大時就出現(xiàn)異常。
鑒于PCKO小鼠的線粒體缺陷以及線粒體移植在其他神經(jīng)疾病中的治療潛力，研究人員將野生型小鼠肝臟來源的線粒體用腦立體定位注射系統(tǒng)注射到PCKO小鼠的小腦中。在移植前，研究人員對分離的線粒體進行了嚴格的質(zhì)量控制，確保其生物活性、純度和完整性。
研究發(fā)現(xiàn)，移植線粒體的1月齡CBNDgeneral小鼠和CBNDTdTomato小鼠在運動功能上有顯著改善，表現(xiàn)為平衡木測試中通過時間縮短、后足滑倒次數(shù)減少，同時PCs數(shù)量增加，小腦萎縮得到緩解。不過，這種治療效果在成年CBNDgeneral小鼠中并不明顯，這提示足夠數(shù)量的PCs對于線粒體移植發(fā)揮治療作用至關(guān)重要。
深入探究作用機制
研究人員進一步深入探究線粒體移植后的作用機制。他們發(fā)現(xiàn)，移植的線粒體能夠進入PCs，并在其中持續(xù)存在至少4周，且能與內(nèi)源性線粒體相互作用。同時，線粒體移植顯著改善了PCs的線粒體形態(tài)和功能，增加了ATP水平，增強了線粒體膜電位，減少了ROS生成，還緩解了Caspase3介導的細胞凋亡和Parkin依賴的線粒體自噬。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，缺乏DRP1或呼吸能力的線粒體無法改善CBNDgeneral小鼠的行為異常，這表明移植線粒體的功能完整性是發(fā)揮治療效果的關(guān)鍵。
本研究構(gòu)建了多種基因編輯小鼠模型，實現(xiàn)對疾病精準模擬。在實驗過程中，對移植線粒體質(zhì)量進行嚴格把控。在分離線粒體時，采用特定試劑盒及規(guī)范流程，確保線粒體純度。通過Mitotracker染色等多種方法評估線粒體生物活性和完整性，確保其質(zhì)量上乘。使用腦立體定位注射技術(shù)（瑞沃德腦立體定位注射系統(tǒng)）將健康的肝臟來源線粒體精準地注射到實驗小鼠的小腦中，整個線粒體移植過程嚴格控制在1小時內(nèi)，且對移植后不同時間點的線粒體進行追蹤檢測，確保實驗數(shù)據(jù)可靠，為研究結(jié)論提供堅實支撐。
本研究綜合運用多種技術(shù)，從分子、細胞和整體水平全面解析線粒體移植機制與效果。免疫熒光染色和RNAscope原位雜交，可在細胞層面精準定位和定量分析蛋白與基因表達，直觀呈現(xiàn)相關(guān)分子變化。線粒體相關(guān)檢測技術(shù)，包括線粒體分離、膜電位檢測、ROS水平測定等，從生化角度深入剖析線粒體功能，為揭示線粒體移植對PCs的影響提供關(guān)鍵數(shù)據(jù)。行為學測試如轉(zhuǎn)棒測試、平衡木測試，能在整體動物水平評估運動功能，反映疾病發(fā)展及治療干預效果。
截止目前，瑞沃德產(chǎn)品及服務覆蓋海內(nèi)外 100 多個國家和地區(qū)，已助力全球1000+科研院所，2500+醫(yī)院，6000+高等院校，15000+寵物醫(yī)療機構(gòu)，18000+生物醫(yī)藥類企業(yè)，助力發(fā)表SCI文章14500+篇，贏得了40000+客戶的信賴和支持。
神經(jīng)退行性疾病的特征是神經(jīng)元功能進行性受損和喪失，小腦神經(jīng)退行性疾病（CBND）則表現(xiàn)為小腦性共濟失調(diào)，像共濟失調(diào)毛細血管擴張癥、脊髓小腦共濟失調(diào)等都屬于此類。線粒體功能障礙在神經(jīng)退行性疾病中扮演著關(guān)鍵角色，尤其是浦肯野細胞（PCs）中的線粒體損傷，被認為是CBND的核心發(fā)病機制之一。因此，針對PCs中線粒體的干預措施，有望成為治療CBND的有效策略。線粒體移植技術(shù)已應用于兒科心肌缺血患者，并在動物模型和細胞系研究中顯示出對神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療潛力，但它在治療CBND方面的效果和機制仍有待探索。
構(gòu)建小鼠模型，模擬疾病進程
圖1. 小腦神經(jīng)變性模型（CBND）構(gòu)建
線粒體移植改善小腦神經(jīng)變性
為探究補充Drp1能否改善共濟失調(diào)癥狀，研究人員在1月齡CBNDgeneral小鼠的小腦中注射Drp1-DIO-OE病毒，使Drp1基因過表達。然而，行為學測試結(jié)果顯示，Drp1過表達并未改善小鼠的協(xié)調(diào)能力和平衡能力，這表明單純上調(diào)Drp1無法有效緩解PCs的退化和運動功能障礙。鑒于PCKO小鼠的線粒體缺陷以及線粒體移植在其他神經(jīng)疾病中的治療潛力，研究人員將野生型小鼠肝臟來源的線粒體用腦立體定位注射系統(tǒng)注射到PCKO小鼠的小腦中。在移植前，研究人員對分離的線粒體進行了嚴格的質(zhì)量控制，確保其生物活性、純度和完整性。
圖2. CBND小鼠小腦線粒體移植（作者使用瑞沃德公司腦立體定位注射系統(tǒng)進行線粒體移植）
研究發(fā)現(xiàn)，移植線粒體的1月齡CBNDgeneral小鼠和CBNDTdTomato小鼠在運動功能上有顯著改善，表現(xiàn)為平衡木測試中通過時間縮短、后足滑倒次數(shù)減少，同時PCs數(shù)量增加，小腦萎縮得到緩解。不過，這種治療效果在成年CBNDgeneral小鼠中并不明顯，這提示足夠數(shù)量的PCs對于線粒體移植發(fā)揮治療作用至關(guān)重要。
圖3. 線粒體移植后早期效果評估
深入探究作用機制
圖4. 外源性線粒體示蹤
圖5. 線粒體移植改善 CBND 小鼠功能的機制探究
研究方法亮點
這項研究首次證實了在線粒體移植減少了神經(jīng)退行性病變小腦內(nèi)PCs的凋亡和線粒體自噬，從而延緩小腦神經(jīng)退行性變，為小腦神經(jīng)退行性疾病的治療提供了新的方向。本研究構(gòu)建了多種基因編輯小鼠模型，實現(xiàn)對疾病精準模擬。在實驗過程中，對移植線粒體質(zhì)量進行嚴格把控。在分離線粒體時，采用特定試劑盒及規(guī)范流程，確保線粒體純度。通過Mitotracker染色等多種方法評估線粒體生物活性和完整性，確保其質(zhì)量上乘。使用腦立體定位注射技術(shù)（瑞沃德腦立體定位注射系統(tǒng)）將健康的肝臟來源線粒體精準地注射到實驗小鼠的小腦中，整個線粒體移植過程嚴格控制在1小時內(nèi)，且對移植后不同時間點的線粒體進行追蹤檢測，確保實驗數(shù)據(jù)可靠，為研究結(jié)論提供堅實支撐。
本研究綜合運用多種技術(shù)，從分子、細胞和整體水平全面解析線粒體移植機制與效果。免疫熒光染色和RNAscope原位雜交，可在細胞層面精準定位和定量分析蛋白與基因表達，直觀呈現(xiàn)相關(guān)分子變化。線粒體相關(guān)檢測技術(shù)，包括線粒體分離、膜電位檢測、ROS水平測定等，從生化角度深入剖析線粒體功能，為揭示線粒體移植對PCs的影響提供關(guān)鍵數(shù)據(jù)。行為學測試如轉(zhuǎn)棒測試、平衡木測試，能在整體動物水平評估運動功能，反映疾病發(fā)展及治療干預效果。
截止目前，瑞沃德產(chǎn)品及服務覆蓋海內(nèi)外 100 多個國家和地區(qū)，已助力全球1000+科研院所，2500+醫(yī)院，6000+高等院校，15000+寵物醫(yī)療機構(gòu)，18000+生物醫(yī)藥類企業(yè)，助力發(fā)表SCI文章14500+篇，贏得了40000+客戶的信賴和支持。
瑞沃德定位儀家族
文獻原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-025-58189-4
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