提起細胞培養(yǎng)，污染是一個沒有辦法繞過去的問題。除了支原體污染，還有一種是大家都聽過，都覺得自己經歷過，但大家都說不清是什么東西的污染，那就是所謂的“黑膠蟲”污染。

說到“黑膠蟲”污染是什么，大家都說不清，【CELLCOOK賽庫生物】整理并分析了網上的說法：

“黑點”主要分為兩大類：一類是生物，一類是非生物。

先來看生物類

01 原蟲

這個就是最開始的，也是傳說中的那個“黑膠蟲”的來源。翻查文獻，的確找到兩篇中文文獻與此相關，具體名字為：“牛血清中新發(fā)現(xiàn)一種對細胞培養(yǎng)有害的微生物”[1]，發(fā)表于1988年，發(fā)表雜志為《中國畜禽傳染病》；另一篇為：“牛血清中發(fā)現(xiàn)一種對細胞培養(yǎng)有害的單細胞生物”[2]，發(fā)表于1991年，雜志為《中國畜牧雜志》。兩篇文獻可能受限于當時的研究狀況，或者文章發(fā)表的慣例，通篇沒有方法與結果，有的只是語言描述，完全不清楚是如何開展的實驗及如何得出具體的結果的。根據(jù)文章里的描述，單純的血清就能觀察到這種“膠原蟲”，且37℃放置一個月可見明顯沉淀，顯示該“膠原蟲”增殖緩慢，明顯不是細菌或真菌，常規(guī)消毒滅菌方法均耐受暗示該“原蟲”不是生物體，而是蛋白或鈣鹽沉淀一類的顆粒物。另外，根據(jù)CNKI的搜索結果，這兩篇文獻均沒有被引用，也沒有找到后續(xù)研究，按現(xiàn)在網上找到的說法，是當時沒有研究經費，項目沒有繼續(xù)下去。但根據(jù)兩篇文獻里的描述，該“原蟲”可以耐受高溫滅菌，紫外照射，常規(guī)消毒劑處理和輻照，絕對是水熊蟲級別的發(fā)現(xiàn)，但30年過去，以現(xiàn)在科研經費的情況，竟然沒有任何的跟進研究，這不能不說是很可惜的，或者說是很明智的。

02 納米細菌

這個多見于國外的文獻，名字為nanobacteria。同樣在1988年，由芬蘭科學家在細胞培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)。該“細菌”表面覆蓋有鈣化外殼，能耐受高溫和強酸。后在各種疾病中發(fā)現(xiàn)，如腎結石、膽結石、動脈斑塊等。但后續(xù)實驗發(fā)現(xiàn)該“細菌”不含有DNA和RNA，且其行為方式與碳酸鈣顆粒高度相似。最后被認定為非生物體[3]。

03 支原體

支原體在光鏡下不可見，原則上在光鏡下觀察到的“黑點”不可能是支原體。但不能排除細胞感染支原體之后，細胞狀態(tài)受到影響，狀態(tài)不佳導致細胞碎片增多。而且隨著支原體感染程度加深，細胞狀態(tài)變得更差，碎片增多，黑點增多，導致“黑膠蟲”感染加深的錯覺。這種情況下，使用針對支原體的抗生素可以減輕細胞所受的影響，碎片減少，所謂“黑膠蟲”的污染情況得到改善。

04 細菌/真菌

根據(jù)2010年發(fā)表的一篇文獻，作者在其細胞培養(yǎng)液中分離了里面的“黑點”，檢測了其中的核酸，并測序做了聚類分析，證實了其培養(yǎng)液中的黑點是一種無色桿菌[4]。按此推測，只要在形狀上相似而且可在細胞培養(yǎng)基中生長的細菌或真菌均有可能會被當成是所謂的“黑膠蟲”。但細菌或真菌與細胞間是共用培養(yǎng)環(huán)境，是競爭關系，才會出現(xiàn)網傳的細胞狀態(tài)好，黑點少的現(xiàn)象。但細菌/真菌的污染一般都會快速令培養(yǎng)液變黃變渾濁，或產生沉淀等較明顯感染現(xiàn)象。且可通過16S/18S的檢測分辨具體感染的菌株。這時候，對應的抗生素是可以快速有效殺滅此類污染，如前面提到的無色桿菌，作者正是使用了環(huán)丙沙星/哌拉西林對癥處理，快速消除污染。這兩種抗生素估計就是現(xiàn)在市場上推銷的所謂“黑膠蟲清除試劑”的主要成分（可能還加入了抗真菌藥物）。但正如前面提到的，有可能不同操作者的黑點是不同種的細菌或真菌，上述的抗菌藥物不一定能有效殺滅，且長期使用抗生素同樣會對細胞產生毒副作用，細胞狀態(tài)難以恢復。

介紹完生物類，接下來介紹非生物類

01 二氧化硅顆粒

早期細胞培養(yǎng)用玻璃培養(yǎng)瓶，可能有二氧化硅顆粒，但應該是一過性的，不會持續(xù)產生。且現(xiàn)在大多用塑料的一次性培養(yǎng)瓶，應該不會再產生類似問題。

02 細胞碎片

細胞在衰亡時會產生的凋亡小體等碎片，而當細胞狀態(tài)變差時，所產生的碎片也會增多。這樣會容易產生一種“黑點”增多導致細胞狀態(tài)變差的錯覺。相反，如此時及時換液或調整細胞狀態(tài)，細胞狀態(tài)好了，衰亡產生的碎片自然減少，從而產生了一種“黑點”與細胞競爭的錯覺，從而誤斷“黑點”是一種污染。如果細胞只是單純的因為沒有及時換液，或者所用培養(yǎng)基不合適等單純培養(yǎng)條件導致的細胞狀態(tài)變化產生的“黑點”，使用抗生素是沒有作用的；但如果是支原體等污染導致的細胞狀態(tài)變差，使用針對性的抗生素治療，是可以使細胞狀態(tài)變好，“黑點”減少的。

03 鈣鹽顆粒/蛋白沉淀

血清成分復雜，含有各種的離子，蛋白。凍融的過程會讓一部分變性的蛋白在缺少伴侶蛋白的作用下無法完全復性，從而形成沉淀析出。這就是血清中“黑點”形成的部分原因。國外血源的質量相對較好，且取血過程相對成熟穩(wěn)定，血清中的蛋白析出較少，“黑點”較國內血清要少，這就是“國內血清相對較臟”說法的來源。而熱滅活的過程會促使蛋白質變性，產生沉淀，形成更多的“黑點”。培養(yǎng)基或血清在37℃下放置，鈣離子會產生諸如碳酸鈣、磷酸鈣等沉淀，蛋白質也會析出或形成沉淀，從而產生更多“黑點”，產生“黑點”增殖的假象。但這個過程相對緩慢，就會產生“膠原蟲”文獻里出現(xiàn)的37℃放置一個月后觀察到沉淀的現(xiàn)象，而不是一周或兩周就產生明顯的沉淀。

以上就是網上能找到的說法的綜合分析。不難發(fā)現(xiàn)，所謂的“黑點”，要不就是不太常見的細菌或者真菌污染，要不就是細胞狀態(tài)不好等情況產生的細胞碎片或者是蛋白和鈣鹽等的沉淀。而所謂的“黑膠蟲”，可能是受當時研究或觀察手段所限，或對一些現(xiàn)象觀察后思考不周，沒有嚴格驗證而所產生的錯誤結論。正如這里總結的，不同的培養(yǎng)者遇到的“黑點”可能都是不一樣的，或污染或碎片，但就因為都是一些黑色的顆粒，就將其簡單地歸為那虛無縹緲的“黑膠蟲”，這是非常缺乏科學精神的行為，也非常不應該出現(xiàn)在科研工作者身上的。相反，我們應該對出現(xiàn)了“黑點”的細胞進行仔細的分析，認真找出導致“黑點”產生的真正原因。才能真正的解決“黑點”的問題，減少“黑點”出現(xiàn)的頻率。

這里，我們給出一點思路：
“黑點”的出現(xiàn)是系統(tǒng)性的還是只是在個別細胞身上？如果是前者，考慮是否共用的試劑出現(xiàn)污染還是品質出現(xiàn)問題；如果是后者，則考慮細胞的培養(yǎng)條件是否合適，或者是否污染。
而對于疑似的污染，可嘗試富集“黑點”后提取DNA，擴增16S或18S基因并測序，比對后確認污染的是什么菌，并對癥治療。而不是隨便在外面買個所謂的“黑膠蟲清除試劑”一通亂加，這才是對細胞最好的處理。

以上，在“黑點”出現(xiàn)的時候，你真的了解你的細胞經歷了什么了嗎？