在生物制藥領(lǐng)域，抗體藥物的生產(chǎn)過程中，抗體聚體的形成一直是困擾研發(fā)人員的難題。聚體不僅會降低藥物的療效，還可能引發(fā)免疫反應(yīng)，嚴(yán)重影響藥物的安全性和有效性。

今天，博格隆給大家分享一篇關(guān)于不同層析填料去除抗體聚體能力的研究，希望能為大家提供一些有益的參考。

抗體聚體的形成通常與抗體分子的疏水區(qū)域暴露、二硫鍵異構(gòu)化和分子間結(jié)構(gòu)域交換有關(guān)。這些聚體在細(xì)胞培養(yǎng)收獲物中含量較高，不僅降低抗體藥物的生物活性，還可能引發(fā)免疫反應(yīng)。鑒于這些聚體難以通過傳統(tǒng)的純化方法完全去除，因此開發(fā)高效的聚體去除方法，對于提高抗體藥物的質(zhì)量至關(guān)重要。

實(shí)驗(yàn)過程與實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)過程

在這項(xiàng)研究中，研究人員選取了八種不同類型的層析填料，包括疏水相互作用（HIC）層析填料、羥基磷灰石（HA）層析填料和混合模式層析填料，對一種在CHO細(xì)胞中表達(dá)的單克隆抗體（mAb）進(jìn)行聚體去除測試。

實(shí)驗(yàn)中，首先使用Protein A和陰離子交換（AEX）層析法對抗體進(jìn)行初步純化，得到含有約14%聚體的中間產(chǎn)物。隨后，分別在不同的層析條件下，對這些層析填料的聚體去除能力進(jìn)行評估。

實(shí)驗(yàn)方法

● 層析柱：所有填料都裝在直徑為0.66cm、床高為15cm的柱子中。使用不同的緩沖液配方進(jìn)行層析實(shí)驗(yàn)。

● 分析方法：SEC-HPLC，所有樣品使用Tosoh TSKgel G3000SWXL不銹鋼柱進(jìn)行分析，上樣量100μg樣品，流速為1.0mL/min，流動相為50mM磷酸鈉和300mM氯化鈉，pH6.8。

在上樣樣品中添加高濃度鹽，使聚體結(jié)合，而單體流穿（FT）。聚體水平在FT中降低至1%以下，表明HIC層析在去除聚體方面具有很高的效率。

對于疏水層析，即便配基相同，不同材質(zhì)的疏水填料也可能具有不同的疏水表現(xiàn)，樣品結(jié)合的鹽濃度需求也可能不同。因此，需要針對不同的樣品選擇合適的結(jié)合和洗脫條件以期達(dá)到理想的聚體分離效果。

對該實(shí)驗(yàn)中的mAb進(jìn)行羥基磷灰石填料結(jié)合-洗脫模式純化，結(jié)果顯示使用鈉鹽梯度洗脫，比磷酸鹽梯度洗脫效果更好。

在洗脫緩沖液中添加PEG，可以顯著提高分離效果。這表明PEG的添加可以增強(qiáng)聚體的柱上保留，從而實(shí)現(xiàn)更好的分離。

使用高分辨率的陽離子混合模式層析填料在pH5.5下進(jìn)行結(jié)合洗脫模式純化，使用鹽梯度線性洗脫，可以實(shí)現(xiàn)高純度的單體洗脫，但洗脫峰有拖尾現(xiàn)象。使用精氨酸梯度洗脫可以改善分離效果。這表明精氨酸可以有效破壞聚體與層析填料的相互作用，從而提高分離效果。

采用同種配基，粒徑較大的陽離子混合模式層析填料在相同條件下，分離效果不如前一種，但添加PEG可以提高分離效果。這表明PEG的添加可以增強(qiáng)聚體的保留，從而實(shí)現(xiàn)更好的分離。

采用強(qiáng)陰離子混合模式層析填料在pH7.0下運(yùn)行，使用線性精氨酸梯度洗脫，可以實(shí)現(xiàn)高純度的單體洗脫，但洗脫峰尾部純度較低。添加PEG可以提高洗脫液純度，但會增加洗脫體積。最終，使用步階精氨酸洗脫和調(diào)整合適的PEG梯度可以實(shí)現(xiàn)單體高純度和小洗脫體積。

在典型線性鹽梯度層析條件下，CEX層析無法有效分離單體和聚體。但在洗脫緩沖液中添加PEG，可以顯著提高分離效果，使單體和聚體完全分離，且通過進(jìn)一步開發(fā)分步洗脫方法保持產(chǎn)品質(zhì)量和收率。這表明PEG的添加可以顯著提高CEX層析的分離效果。

主要結(jié)論

多種層析填料的有效性

HIC和HA填料在去除聚體方面表現(xiàn)出強(qiáng)大的能力。混合模式層析填料也顯示出良好的聚體去除效果。

PEG和精氨酸的顯著作用

在純化過程中添加PEG和/或精氨酸可以顯著提高分離效果，尤其是在CEX層析中，PEG的添加可使單體和聚體完全分離。

操作參數(shù)的優(yōu)化

對于每種填料，需要通過實(shí)驗(yàn)確定最佳的操作參數(shù)，以實(shí)現(xiàn)最大的聚體清除和單體回收率。在大規(guī)模生產(chǎn)中，步階洗脫比線性梯度洗脫更有利于減少處理時(shí)間和洗脫體積。

在抗體聚體去除方面，選擇合適的層析填料至關(guān)重要。無論您是進(jìn)行基礎(chǔ)研究還是工業(yè)化生產(chǎn)，博格隆的填料都能為您提供可靠的解決方案。

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[1] Zhang X, Chen T, Li Y. A parallel demonstration of different resins' antibody aggregate removing capability by a case study. Protein Expression and Purification. 2019;153:59-69. DOI: 10.1016/j.pep.2018.08.011.