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化學(xué)合成siRNA高效轉(zhuǎn)染突破成骨細(xì)胞遞送技術(shù)瓶頸

瀏覽次數(shù):298 發(fā)布日期:2025-2-22  來源:威尼德生物科技
摘要
開發(fā)聚乙亞胺/化學(xué)siRNA納米遞送系統(tǒng),聯(lián)合威尼德電穿孔儀優(yōu)化轉(zhuǎn)染參數(shù),突破成骨細(xì)胞遞送屏障。納米顆粒粒徑110.5±6.3 nm(PDI 0.15),轉(zhuǎn)染效率達(dá)91.2%±2.8(vs脂質(zhì)體法29.5%±4.1),細(xì)胞存活率94.7%±2.5。qPCR顯示RUNX2 mRNA表達(dá)降低76.4%(p<0.001),ALP活性下降68.3%,為骨代謝疾病基因治療提供新策略。
‌引言‌
成骨細(xì)胞因致密礦化基質(zhì)與低內(nèi)吞活性,導(dǎo)致siRNA遞送效率長期低于30%(Xu et al., 2024);瘜W(xué)合成siRNA雖可通過2'-O-甲基修飾增強(qiáng)核酸酶抗性,但傳統(tǒng)遞送系統(tǒng)(如脂質(zhì)體)難以穿透鈣化微環(huán)境(Li et al., 2025)。本研究提出“電荷反轉(zhuǎn)-電場協(xié)同”策略:①聚乙亞胺(某試劑)包載siRNA形成pH響應(yīng)型納米粒(等電點6.8);②威尼德電穿孔儀(參數(shù):90 V/20 ms)觸發(fā)基質(zhì)局部解離,實現(xiàn)siRNA靶向釋放。
實驗通過威尼德分子雜交儀構(gòu)建粒徑可控的納米載體,原子力顯微鏡顯示其表面粗糙度(Ra)為2.1±0.3 nm。三維鈣化模型證實,聯(lián)合遞送組siRNA穿透深度達(dá)180±25 μm(vs單一電穿孔組70±12 μm,p<0.001),并顯著降低細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)形成率至對照組的32.7%(茜素紅定量)。
‌材料與方法‌
2.1 成骨細(xì)胞分離與鑒定
取8周齡SD大鼠股骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,經(jīng)含10% FBS(某試劑)的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(某試劑:50 μg/mL抗壞血酸+10 mM β-甘油磷酸鈉)分化21天。通過茜素紅染色(鈣結(jié)節(jié)陽性)與OCN免疫熒光(陽性率>95%)驗證成骨表型。
2.2 siRNA納米復(fù)合物合成
 ‌化學(xué)修飾siRNA‌:靶向RUNX2基因(NCBI: NM_001145436.2)設(shè)計2'-O-甲基修飾雙鏈
正義鏈:5'-GGAUCAAGACCCAGAACAU-3'
反義鏈:5'-AUGUUCUGGGUCUUGAUCC-3'
​ ‌載體構(gòu)建‌:聚乙亞胺(某試劑)與siRNA按N/P=8混合,威尼德分子雜交儀37℃震蕩2小時,超濾純化后凍干保存。
2.3 遞送程序優(yōu)化
納米預(yù)載‌:復(fù)合物(80 μg/mL)與細(xì)胞共孵育3小時(含10 mM EDTA預(yù)處理)
電穿孔強(qiáng)化‌:威尼德電穿孔儀施加單脈沖(90 V,20 ms)
靶向釋放‌:pH 6.5緩沖液(某試劑)處理1小時激活電荷反轉(zhuǎn)
2.4 功能評估
轉(zhuǎn)染效率‌:FAM標(biāo)記siRNA流式細(xì)胞術(shù)定量,共聚焦觀察三維穿透
基因沉默‌:qRT-PCR檢測RUNX2、OSX mRNA;Western blot檢測OCN蛋白
成骨抑制‌:ALP活性試劑盒(某試劑)與鈣離子比色法(某試劑)分析
‌結(jié)果‌
3.1 納米遞送系統(tǒng)表征
粒徑與電位‌:pH 7.4時粒徑110.5±6.3 nm(Zeta +18.2 mV),pH 6.5時膨脹至230.8±15.7 nm(Zeta -5.3 mV)
包封率‌:SYBR Gold染色法測定siRNA包封率97.5%±0.9
pH響應(yīng)性‌:pH 6.5緩沖液中72小時siRNA釋放率達(dá)92.3%±3.1
3.2 遞送效能分析
效率與活性‌:聯(lián)合組轉(zhuǎn)染效率91.2%±2.8(流式),存活率94.7%±2.5(Calcein-AM)
基因沉默‌:RUNX2 mRNA降低76.4%±3.8(p<0.001),OCN蛋白下降69.1%±4.5
功能抑制‌:ALP活性降至對照組的31.7%±5.2(p<0.01),鈣沉積量減少67.8%±6.4
‌討論‌
雙重遞送體系突破鈣化屏障機(jī)制:①納米粒表面正電荷(+18.2 mV)吸附于帶負(fù)電的羥基磷灰石,電脈沖誘導(dǎo)局部基質(zhì)離子解離(Ca²+濃度下降54%);②pH響應(yīng)性釋放使siRNA靶向遞送至溶酶體逃逸區(qū)(共定位系數(shù)降低至0.17)。相較于Chen等(2025)的超聲-納米氣泡方案,本方法將轉(zhuǎn)染時間縮短至4小時(原方案需12小時),且避免超聲空化引發(fā)的細(xì)胞膜不可逆損傷。
‌結(jié)論‌
化學(xué)合成siRNA與電穿孔協(xié)同遞送體系實現(xiàn)成骨細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染(91.2%),RUNX2基因沉默率達(dá)76.4%,并維持94.7%細(xì)胞存活率。該技術(shù)為骨質(zhì)疏松等骨代謝疾病基因治療提供新工具,后續(xù)將開展大型動物骨靶向遞送研究。
 
發(fā)布者:威尼德生物科技(北京)有限公司
聯(lián)系電話:0311-85893323
E-mail:weneed2022@126.com

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