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微量丙二醛(MDA)測試

瀏覽次數(shù):832 發(fā)布日期:2025-1-3  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負
一、測試原理:
過氧化脂質降解產物中的丙二醛(MDA)可與硫代巴比妥酸(TBA)縮合,形成紅色產物,在532nm處有最大吸收峰。因底物為硫代巴比妥酸(ThibabituricAcidTBA)所以此法稱TBA法。
二、測試所需儀器耗材和試劑:
含532nm波長的分光光度計(上海美析儀器有限公司)及1cm光徑比色皿(或酶標儀及96孔板)、95℃水浴鍋、電爐(配試劑加熱用)、臺式低速離心機、各種規(guī)格移液器、雙蒸水、無水乙醇、生理鹽水(0.9%)或PBS(0.1M)、冰醋酸(分析純,乙酸濃度≥99.5%)、渦旋混勻器、離心管、蛋白測定試劑(組織及細胞樣本用,本公司有售)。
三、試劑盒組成與配制:(試劑盒有效期1年)

四、規(guī)范操作方法:
1、樣本前處理:
血清(漿)樣本:直接使用;
細胞培養(yǎng)液樣本:取部分3500rpm/分鐘離心10分鐘后取上清待測;
組織樣本:稱取組織重量,按照重量(g):體積(mL)=1:9的比例加入9倍體積生理鹽水,剪碎組織,冰水浴制備成勻漿液待測(勻漿液也可3500rpm/分鐘離心10分鐘后取上清(10%勻漿上清)測定,此時上清液需要同時測定其蛋白濃度,計算時用公式(3));
培養(yǎng)細胞樣本:
收集細胞:①、懸浮培養(yǎng)的細胞,可直接通過離心收集沉淀細胞(1000轉/分,離心10分鐘,棄上清留沉淀細胞);②、貼壁培養(yǎng)的細胞,吸去上清,可通過細胞刮直接將細胞刮下;或者是用0.25%的胰酶室溫消化2~3分鐘,加培養(yǎng)液終止消化,用微量移液器輕輕吹打,將所有液體吸出轉入EP管,然后1000轉/分,離心10分鐘棄上清,留沉淀細胞,再加入1mLPBS輕輕吹打,再次1000轉/分,離心10分鐘棄上清,留沉淀細胞待用。如暫時不做,則可以將細胞低溫凍存,溫度越低越好。
細胞破碎:(以下任選一種)(破碎后可以用本所的BCA或考馬斯亮藍試劑盒測定蛋白濃度,用于計算)
①、研磨破碎:在細胞沉淀中加入一定量(106數(shù)量級的細胞一般加0.3~0.5mL)的緩沖液(緩沖液可以用PBS或者是生理鹽水),用手動玻璃勻漿器冰水浴研磨3~5分鐘,或者是用卡富隆電動研磨器冰水浴研磨3分鐘待測;
②、超聲破碎:在細胞沉淀中加入一定量(106數(shù)量級的細胞一般加0.3~0.5mL)的緩沖液(緩沖液可以用PBS或者是生理鹽水),需保證超聲探頭在液面以下。功率300W,冰水浴,每3~5S超聲一次,間隔4次(每次間隔時間為30S左右);(推薦此法)
③、反復凍融:可以用液氮進行反復凍融,讓細胞在EP管或者是凍存管中加入一定量的低滲液或者蒸餾水,直接放入液氮中3~5秒,立即提出轉入-20℃冰箱(20~30秒),再取出室溫解凍,解凍后再按前面重復3次。(注意從液氮中取出不可直接置于室溫解凍,這樣EP管等容易炸裂導致樣本損失,所以一定要用冷凍進行梯度解凍);
④化學裂解:貼壁培養(yǎng)的細胞,可直接將上清吸去后,直接在孔板或是瓶中加入一定量的裂解液(推薦用1%-2%的TritonX-100,覆蓋滿細胞),置冰上裂解30~40分鐘(可用顯微鏡觀察細胞破碎情況,如效果不好可延長時間),再用微量移液器吸出待測。
2、操作表:

①、對照管每個樣本都需要做,表內所有試劑可以按比例增大或縮小,結果不變。
②、細胞勻漿液或細胞培養(yǎng)上清液可上樣0.30.4mL
③、規(guī)范操作方法標準管參考吸光度:標準管吸光度減去空白管的吸光度為0.130~0.140(1cm光徑),用酶標儀讀數(shù)時,此值在0.075~0.090。
④、預試時,若發(fā)現(xiàn)檢測樣本吸光度太低,正式實驗時可以將水浴時間40分鐘延長至80分鐘,但同一課題中MDA的水浴都必須用80分鐘,以免造成批間差異。
3、計算公式:
1)、血清(漿)、細胞培養(yǎng)液中MDA含量計算公式:

2)、組織中MDA含量計算公式:

3)、細胞或組織勻漿上清中MDA含量計算公式:

注:
發(fā)布者:上海美析儀器有限公司
聯(lián)系電話:400-6164686
E-mail:wuhua@macylab.cn

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