新學(xué)期開始，剛進(jìn)實驗室的“實驗小白”開始苦惱了：師兄師姐都說PCR實驗很簡單，然而我的PCR實驗卻反復(fù)沒有結(jié)果，實在讓人頭疼。

不要急，本文整理了PCR實驗中可能遇到的一些問題，幫助大家輕松掌握PCR實驗！

1. 1、PCR產(chǎn)物的電泳檢測時間

一般為48h以內(nèi)，有些最好于當(dāng)日電泳檢測，大于48h后帶型不規(guī)則甚至消失。

2. 2、假陰性，不出現(xiàn)擴增條帶

一、模板核酸的制備：模板中含有雜蛋白質(zhì)、Taq酶抑制劑；在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚；模板核酸提取過程出現(xiàn)問題。

二、酶的質(zhì)量及活性：酶失活需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。

三、引物的質(zhì)量與特異性：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見原因。

引物設(shè)計對策：①選定一個好的引物合成單位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。④引物設(shè)計不合理，如引物長度不 夠，引物之間形成二聚體等。

四、PCR循環(huán)條件：變性對PCR擴增來說相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現(xiàn)假陰性；退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴增效率。因此擴增儀溫度的準(zhǔn)確性和均一性是獲得穩(wěn)定擴增的保障。

艾普拜生物的精衛(wèi)自動PCR儀采用鍍金槽的設(shè)計，不僅具有優(yōu)異的熱傳導(dǎo)性能，能夠快速且均勻地傳遞熱量，使PCR反應(yīng)體系中的溫度變化更加迅速和準(zhǔn)確，可以提高反應(yīng)的效率和特異性，減少非特異性擴增的出現(xiàn)。而且具有良好的溫度均勻性，使得熱量能夠在槽內(nèi)均勻分布，確保每個樣品孔位的溫度基本一致，提高實驗結(jié)果的可靠性和可重復(fù)性。

3. 3、假陽性

出現(xiàn)的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。

一、引物設(shè)計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴增時，擴增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計引物。

二、靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染：整個基因組或大片段的交叉污染或者是空氣中的小片段核酸污染。 

4. 3、出現(xiàn)非特異性擴增帶

PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶與非特異性擴增帶。

非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。

其次是酶的質(zhì)量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增。

  精衛(wèi)自動PCR儀  

精衛(wèi)自動PCR儀有Kingwell 96、Kingwell 96DW和Kingwell 384三款型號可選，能夠滿足不同通量的實驗需求。所有型號均采用鍍金樣品槽，能夠帶來更好的溫控性能和更快的升降溫速度。同時所有型號均采用簡潔現(xiàn)代的外觀設(shè)計，搭配10.1英寸彩色觸控屏和智能化操作系統(tǒng)，帶來更高效便捷的實驗體驗。