RAD-Seq（Restriction-site Associated DNA Sequence），對全基因組中處于限制性內切酶酶切位點附近的片段進行測序。RAD-Seq是開發單核苷酸多態性（SNPs）的高效方法，可用于遺傳連鎖圖譜的構建、QTL定位、群體遺傳分析等。

 

相比全基因組測序，RAD-Seq具有如下優勢：
（1）大幅降低基因組復雜度；
（2）降低建庫和測序成本；
（3）不受參考基因組的限制，研究物種范圍更廣泛；
（4）相同通量情況下，一次測序可檢測更多樣本，尤其適合群體遺傳研究。

ddRAD-Seq是在傳統RAD-Seq基礎上發展而來的雙酶切簡化基因組測序技術，與RAD-Seq的主要區別在于，基因組DNA通過一個稀有限制性內切酶與一個常見限制性內切酶相結合進行雙酶切，免去打斷的步驟直接進行片段篩選后測序。

 

如圖所示，對基因組進行雙酶切并輔以酶切產物的片段大小篩選，得到的序列就是兩端為不同酶切位點且長度接近的片段，如圖中藍色區域。a、b兩處雖然也在不同的酶切位點之間，但因大小不符而被篩除。因此，ddRAD-Seq對DNA文庫的篩選更為嚴格，在通量相同的情況下比單酶切法的測序深度更深，準確度更高，也能檢測更多的樣本，提高數據的利用率。

因此，構建ddRAD-Seq文庫需要對酶切后的基因組DNA進行高精確度的片段篩選，傳統的手工切膠難以達到準確度的要求，Sage Science公司的Pippin系統在此方面表現出強大的優勢。

 

2023年美國密西西比州立大學基因組學和生物技術研究所的科學家發表了一篇“應用新方法的雙酶切限制性位點DNA測序(ddRAD-Seq)進行更高效的SNP鑒定”的方法學文章。新的方案提高了實驗效率并減少了ddRAD-Seq的時長，為了證明其實用性，作者比較了新方案的SNP與來自全基因組重測序數據的SNP。結果表明，相比現有方法，改進的ddRAD-Seq方法在識別系統發育和關聯遺傳研究的單核苷酸多態性分析方面是可靠的，同時降低了成本和時間。

 

Fig 1. 改進的ddRAD-Seq實驗方法流程圖。(A)從基因組DNA提取到測序文庫構建的過程。(B)構建的文庫，經過Sage ELF片段篩選儀進行295—614 bp片段篩選，最后經Illumina Hiseq X Ten測序

在ddRAD-Seq測序文庫制備過程中，使用Sage Science公司的Sage ELF高精度DNA片段分選回收儀對295-614bp的DNA片段，進行準確、高效地回收，確保Illumina測序在最佳片段范圍內。

同時作者也提出嵌合體的存在會造成序列讀取不匹配，為了盡可能減少嵌合體的存在，需要將文庫大小控制在364-444 bp之間，推薦使用Sage Science公司的系列片段回收儀Sage ELF 或 Blue Pippin 作為DNA片段精準篩選回收方法。

 

 

文章是來自復旦大學的科研團隊關于應用ddRAD-seq技術，用于大規模植物種群遺傳多樣性分析。作者開發了一個通用的計算工具，優化植物RAD-seq設計，并通過實驗驗證其有效性。優化的RAD-seq方法能夠在文庫構建過程中去除葉綠體DNA和rRNA基因，同時保持所需的覆蓋均勻性和密度。

 
 

通過優化選擇限制性酶切位點（REs），同時引入精確的DNA片段大小篩選回收技術，顯著提高了RAD-seq的效率和準確性。整個建庫過程中，在兩個步驟上均使用Pippin Prep作為DNA片段大小篩選回收工具（上圖左）。經過DNA片段篩選后，每一個測序文庫超過90%的被測序片段都落在目標大小范圍內（220—420 bp）（上圖右）。

 

期刊：Molecular Ecology（IF5.2）
發表年份：2023年6月7號
物種：龜科——哥倫比亞紅足龜
文庫類型：基于3種限制性內切酶的簡化基因組測序文庫即3RAD-Seq文庫
文庫富集和精準回收：使用 Sage Science公司的Pippin Prep全自動DNA片段分選回收儀對350至450 bp之間的片段大小進行選擇，在Illumina NovaSeq SP平臺進行了文庫測序。

 

期刊：Molecular Ecology（IF 5.2 ）
發表年份：2023年
物種：歐洲熊峰bumblebee specimens (Bombus terrestris)
文庫類型：ddRAD 文庫，A single quaddRAD library
文庫富集和精準回收：利用Sage Science公司的Pippin Prep全自動DNA片段分選回收儀制備quaddRAD文庫，片段大小從450-550 bp精確回收，然后使用Illumina HiSeq 2500平臺進行測序。

Sage Science公司的Pippin系列全自動DNA片段回收系統對于RAD-seq及ddRAD-seq方法在精確回收目標片段，提高測序效率、減少非目標序列的干擾上有重要幫助，是大規模種群遺傳多樣性分析、遺傳連鎖分析、關聯映射、生態和進化研究領域的重要工具。可廣泛用于生命科學、農、林、牧、漁等多方面研究。

文獻：
1、Zenaida V. M et al. “Innovations in double digest restriction-site associated DNA sequencing (ddRAD-Seq) method for more efficient SNP identification” Analytical Biochemistry 662 (2023) 115001
2、Ning Jiang et al. “A highly robust and optimized sequence based approach for genetic polymorphism discovery and genotyping in large plant populations” Theor Appl Genet (2016) 129:1739–1757
3、Natalia GG, Mario VR, H. Bradley Shaffer,et al. "The importance of cryptic diversity in the conservation of wide-ranging species: The red-footed tortoise Chelonoidis carbonarius in Colombia" Molecular Ecology, 2023;32:4531–4545.
4、Paolo F, Carmelo F, Thomas J., et al. "Limited introgression from non-native commercial strains and signatures of adaptation in the key pollinator Bombus terrestris." Molecular Ecology, Volume32, Issue21 November 2023 Pages 5709-5723

 

美國Sage Science是全球領先的全自動DNA脈沖場電泳回收儀的生產廠家，擁有美國技術專利，各個型號產品可以高效完成不同長度范圍的DNA片段的精準回收，廣泛用于二代測序、三代測序以及多種分子生物學相關領域。

環亞生物科技有限公司作為美國Sage Science公司在中國區的獨家代理商，自2011年以來將Sage Science的產品線引入國內，一直為國內用戶提供專業的全自動核酸片段回收儀的安裝測試、應用培訓，技術支持與售后維護工作，贏得客戶的一致好評與信任。環亞生物科技有限公司將一如既往的支持越來越多的Sage Science用戶。


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