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流體誘導(dǎo)分散分析FIDA在進行溶液內(nèi)動力學分析中的應(yīng)用

瀏覽次數(shù):1005 發(fā)布日期:2024-6-27  來源:本站 僅供參考,謝絕轉(zhuǎn)載,否則責任自負

結(jié)合動力學檢測是開發(fā)和表征蛋白類藥物的一個組成部分。目前結(jié)合動力學的常用技術(shù)包括基于BLI和SPR的表面固定測量技術(shù)。表面固定測量技術(shù)具有諸多難點,比如表面化學成分需要優(yōu)化、非特異結(jié)合、需要純化樣本等。

在這里,我們提出了一種新的溶液內(nèi)測量方法(FIDA),僅使用納升到微升的樣品測量結(jié)合動力學。該方法可以應(yīng)用于任何緩沖液條件或基質(zhì)環(huán)境中的蛋白相互作用。它易于設(shè)置,測量分析可全自動化完成。


FIDA,(Flow Induced Dispersion Analysis) 即流體誘導(dǎo)分散分析,基于毛細管中層流運動的分析方法,當樣品通過毛細管時,由于毛細管中心和毛細管壁之間速度不同,毛細管中心速度快,毛細管邊緣速度慢,樣品流動呈拋物線剖面。不同的拋物線剖面(圖1.A)決定了信號曲線的形狀(圖1.B),結(jié)合斯托克愛因斯坦方程和泰勒分散公式,以此實現(xiàn)對分子粒徑(size,流體力學半徑Rh)“第一性原理(first principle)”測量。FIDA的流體動力學半徑測量廣泛適用于生物分子穩(wěn)定性、構(gòu)象變化、相互作用等方面的研究。
 


 

圖1 FIDA基本原理。A. 樣品在毛細管中分散分布示意,橫截面輪廓形狀取決于帶有熒光的分子大小或其與配體形成的復(fù)合物大小;B. 信號峰:樣品流經(jīng)檢測器時產(chǎn)生;C-D. 擴散系數(shù)D和流體力學半徑Rh計算,擬合可得到分子互作親和力KD值等。

除了結(jié)合動力學(Kon和Koff)之外,F(xiàn)IDA還可測量平衡結(jié)合常數(shù)(KD)和流體動力學半徑(Rh)。使用FIDA方法獲得的數(shù)據(jù)與SPR非常吻合。
 


圖 2 親和體與利妥昔單抗相互作用示意圖;親和體作熒光標記。


FIDA溶液動力學檢測

圖3:FIDA溶液內(nèi)動力學的檢測流程

· 該指示劑(indicator)與微流控毛細管內(nèi)的分析物(analyte)混合。指示劑/分析物混合物在壓力驅(qū)動下流過毛細管,當通過探測器時記錄熒光信號。
· 檢測時間隨使用壓力(圖3a)改變。
· 指示劑的信號擬合曲線隨濃度、動力學常數(shù)和 KD (圖3b) 而變化。
· Fidabio數(shù)據(jù)分析軟件模塊擬合數(shù)據(jù)以確定動力學速率常數(shù)(圖3c)。

FIDA和SPR蛋白-蛋白互作動力學數(shù)據(jù)比較

· KD(FIDA) 測量使用FIDA儀器480nm熒光檢測模塊,采用pre-mix分析模式。
· Kon(FIDA)與Koff(FIDA)測量采用cap-mix模式。
· SPR數(shù)據(jù)采用BiacoreX100平臺測量。
· 各平臺測試,均使用PBS緩沖液。

FIDA溶液內(nèi)動力學檢測亮點
1. 溶液中檢測,nL-uL樣品,無需表面固定
2. 快速分析方法開發(fā)----即使復(fù)雜樣品基質(zhì)
3. 實時Rh(結(jié)合化學計量比)測量,熒光強度和每個數(shù)據(jù)點質(zhì)控參數(shù)
4. 動力學:5-10s到數(shù)小時
5. 快速Koff測定----無需表面再生

發(fā)布者:普瑞麥迪(北京)實驗室技術(shù)有限公司
聯(lián)系電話:4006-813-863
E-mail:hzhang@premedlab.com

標簽: FIDA
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