MeRIP-seq等揭示RNA m6A去甲基化酶調控植物雄性不育的分子機制
水稻是全球重要的農作物，也是單子葉植物模型。在水稻中，N6-甲基腺苷（m6A）mRNA修飾對植物的發育和脅迫響應至關重要。OsFIP37作為m6A甲基化復合體的核心組分，其缺乏會導致雄性不育，強調了m6A在雄性生育中的重要性。m6A是一種可逆的修飾，可以被m6A去甲基化酶去除，但m6A去甲基化酶是否調控水稻的雄性育性尚未明確。
北京大學賈桂芳與中國農業科學院萬建民院士團隊合作研究鑒定出水稻RNA m6A去甲基酶（OsALKBH9），并表明其參與水稻雄性育性調控。相關研究成果于2024年4月17日以“OsALKBH9-mediated m6A demethylation regulates tapetal PCD and pollen exine accumulation in rice”為題發表在《Plant Biotechnology Journal》期刊。
標題：OsALKBH9-mediated m6A demethylation regulates tapetal PCD and pollen exine accumulation in rice（OsALKBH9介導的m6A去甲基化調控水稻絨氈層細胞死亡和花粉外壁積累）
時間：2024.4.17
期刊：Plant Biotechnology Journal
影響因子：IF 13.8 / 1區
實驗方法：細胞學分析、轉錄組分析、m6A-seq分析等
研究摘要：
本研究鑒定出mRNA m6A去甲基化酶OsALKBH9，并發現其在參與雄性育性中的調控。OsALKBH9敲除導致水稻雄性不育，且這種雄性不育依賴于其m6A去甲基化活性。細胞學分析揭示了Osalkbh9-1突變體中調控花藥絨氈層細胞死亡（Tapetal Programmed Cell Death, PCD）的缺失和花粉外壁（exine）的過度積累。花藥的轉錄組分析顯示，Osalkbh9-1突變體中與絨氈層發育、花粉壁合成和轉運通路相關的基因表達上調。此外，研究人員驗證了OsALKBH9可以直接去甲基化TDR和GAMYB轉錄本中的m6A修飾，影響了這些mRNA穩定性，并最終導致花粉外壁的過度積累。本研究結果強調了mRNA m6A修飾的精確調控，并揭示了OsALKBH9介導的m6A去甲基化在水稻絨氈層PCD和花粉外壁積累中發揮的關鍵作用。OsALKBH9的發現為雜交育種提供了有價值的雄性不育材料，為理解m6A在植物育性中的作用提供了新視角。
研究方法：
結果圖形
（1）敲除OsALKBH9導致水稻雄性不育，且OsALKBH9在雄性育性中的調控依賴于其m6A去甲基化酶活性
圖1：OsALKBH9在調控水稻雄性育性中的作用及其m6A去甲基化活性的重要性
(a) 利用CRISPR/Cas9技術對OsALKBH9基因進行目標位點突變。
(b) WT、Osalkbh9-1和Osalkbh9-2突變植物抽穗后的表型。
(c) 成熟階段WT、Osalkbh9-1和Osalkbh9-2的稻穗比較。
(d) WT、Osalkbh9-1和Osalkbh9-2植物的小穗。
(e) 用I2/KI溶液染色的WT、Osalkbh9-1和Osalkbh9-2的花粉粒。
(f) 突變體與WT植物雜交的種子設置率（n=10株植物）。
(g-h) 基因互補植物和去甲基化酶活性缺失互補植物的種子設置率（g）和I2/KI溶液中的花粉粒（h）（n = 3株植物）。
(i-k) 重組OsALKBH9蛋白在體外去甲基化含m6A的單鏈RNA（ssRNA）和聚腺苷酸+ RNA（poly A+ RNA），n = 3個生物學重復。(i) 體外去甲基化活性反應消化底物的LC-MS/MS色譜圖。(j, k) 使用ssRNA (j) 和poly A+ RNA (k) 作為底物，在體外去甲基化活性反應后的m6A變化。
(l) 通過LC-MS/MS在14天齡的WT、Osalkbh9-1和Osalkbh9-2莖中純化的mRNA中確定的m6A相對于腺苷的百分比（m6A/A比率）。n = 3個生物學重復。
（2）OsALKBH9是絨氈層PCD和花粉外壁積累所必需
（b） 野生型和Osalkbh9-1花藥從第8~11階段的透射電子顯微照片。
（c） WT和Osalkbh9-1花藥7～11期的TUNEL分析。
E：表皮；En：內皮層；T：絨氈層；PMC：花粉母細胞；MC：減數分裂細胞；Msp：小孢子；dMsp：敗育的小孢子；Tds：四分體；Dy：二元細胞；FL：基座層；Te：外壁。
（3）OsALKBH9在花藥中高表達，主要定位于細胞質中
（b） 轉化了OsALKBH9啟動子驅動的β-葡萄糖醛酸酶（GUS）報告基因的轉基因花藥進行GUS染色，以可視化OsALKBH9表達。
（c） 亞細胞組分和免疫印跡分析。對Osalkbh9-1 OsALKBH9pro:：OsALKBH9CDS-FLAG轉化體的總蛋白、細胞質和細胞核富集級分的SDS-PAGE。UGPase（細胞質標記）和組蛋白H3（細胞核標記）分別進行western blot。
（d） 野生型花藥OsALKBH9轉錄本的原位雜交。
（e） OsALKBH9在本氏N.benthamiana葉表皮細胞中的亞細胞定位。
（4）OsALKBH9缺失影響與雄性育性和花粉外壁（exine）積累相關基因表達
（b） 對第7~8階段和第9~10階段的共上調和共下調基因進行GO分析。左部分表示共上調基因，右半部分表示共下調基因。CC代表細胞組分（cell component），BP代表生物過程（biological process），MF代表分子功能（molecular function）。
（c） qRT-PCR檢測絨氈層發育和花粉外壁積累所需的基因。
（5）OsALKBH9基因功能喪失導致水稻轉錄組范圍內m6A修飾高甲基化
(b) 累積分數圖和箱線圖顯示Osalkbh9-1和WT中m6A峰值的log2（富集倍數）。
(c) meta圖和雷達圖顯示Osalkbh9-1中鑒定出的m6A高甲基化峰值在指定mRNA片段的分布。
(d) 累積分數圖和箱線圖顯示Osalkbh9-1/WT中高甲基化、未變化甲基化和低甲基化峰值的基因表達模式。
(e) 對具有高甲基化峰值的基因進行GO分析。
(f) 基于前1000個峰值，使用HOMER軟件鑒定了依賴OsALKBH9的motif。
（6）OsALKBH9功能喪失導致TDR和GAMYB轉錄本中的m6A高甲基化
圖6：OsALKBH9依賴的m6A去甲基化調控花粉外壁積累。
（a） TDR和GAMYB的相對m6A值。
（b） m6A-IP-qPCR結果顯示WT和Osalkbh9-1的第9~10階段花藥中的相對m6A水平。
（c） Osalkbh9-1 OsALKBH9pro:：OsALKBH9CDS FLAG小穗（第7~12階段花藥）中的RIP-qPCR顯示Osalkbh9直接與TDR和GAMYB轉錄本結合。
（d） WT和Osalkbh9-1小穗（花藥第7~12階段）中TDR和GAMYB的mRNA半衰期。
（e） OsALKBH9如何調控花粉外壁積累的工作模型。在野生型中，OsALKBH9去除TDR和GAMYB轉錄本上的m6A，降低其mRNA穩定性，確保花粉外壁適當積累。在Osalkbh9-1突變體中，TDR和GAMYB轉錄本中m6A高甲基化，促進其mRNA穩定性，激活參與花粉外壁積累的基因表達，導致花粉外壁過度積累和異常的外壁形態。
參考文獻：
Tang J, Lei D, Yang J, Chen S, Wang X, Huang X, Zhang S, Cai Z, Zhu S, Wan J, Jia G. OsALKBH9-mediated mA demethylation regulates tapetal PCD and pollen exine accumulation in rice. Plant Biotechnol J. 2024 Apr 17. doi: 10.1111/pbi.14354. Epub ahead of print. PMID: 38634166.
北京大學賈桂芳與中國農業科學院萬建民院士團隊合作研究鑒定出水稻RNA m6A去甲基酶（OsALKBH9），并表明其參與水稻雄性育性調控。相關研究成果于2024年4月17日以“OsALKBH9-mediated m6A demethylation regulates tapetal PCD and pollen exine accumulation in rice”為題發表在《Plant Biotechnology Journal》期刊。
標題：OsALKBH9-mediated m6A demethylation regulates tapetal PCD and pollen exine accumulation in rice（OsALKBH9介導的m6A去甲基化調控水稻絨氈層細胞死亡和花粉外壁積累）
時間：2024.4.17
期刊：Plant Biotechnology Journal
影響因子：IF 13.8 / 1區
實驗方法：細胞學分析、轉錄組分析、m6A-seq分析等
研究摘要：
本研究鑒定出mRNA m6A去甲基化酶OsALKBH9，并發現其在參與雄性育性中的調控。OsALKBH9敲除導致水稻雄性不育，且這種雄性不育依賴于其m6A去甲基化活性。細胞學分析揭示了Osalkbh9-1突變體中調控花藥絨氈層細胞死亡（Tapetal Programmed Cell Death, PCD）的缺失和花粉外壁（exine）的過度積累。花藥的轉錄組分析顯示，Osalkbh9-1突變體中與絨氈層發育、花粉壁合成和轉運通路相關的基因表達上調。此外，研究人員驗證了OsALKBH9可以直接去甲基化TDR和GAMYB轉錄本中的m6A修飾，影響了這些mRNA穩定性，并最終導致花粉外壁的過度積累。本研究結果強調了mRNA m6A修飾的精確調控，并揭示了OsALKBH9介導的m6A去甲基化在水稻絨氈層PCD和花粉外壁積累中發揮的關鍵作用。OsALKBH9的發現為雜交育種提供了有價值的雄性不育材料，為理解m6A在植物育性中的作用提供了新視角。
研究方法：
- 利用CRISPR/Cas9基因編輯技術在水稻品種Nipponbare中敲除OsALKBH9基因。
- 通過細胞學分析、轉錄組分析、m6A-seq分析等方法研究OsALKBH9的功能和作用機制。
- 利用體外去甲基化實驗和m6A-IP-qPCR等技術驗證OsALKBH9的去甲基化活性。
結果圖形
（1）敲除OsALKBH9導致水稻雄性不育，且OsALKBH9在雄性育性中的調控依賴于其m6A去甲基化酶活性
圖1：OsALKBH9在調控水稻雄性育性中的作用及其m6A去甲基化活性的重要性
(b) WT、Osalkbh9-1和Osalkbh9-2突變植物抽穗后的表型。
(c) 成熟階段WT、Osalkbh9-1和Osalkbh9-2的稻穗比較。
(d) WT、Osalkbh9-1和Osalkbh9-2植物的小穗。
(e) 用I2/KI溶液染色的WT、Osalkbh9-1和Osalkbh9-2的花粉粒。
(f) 突變體與WT植物雜交的種子設置率（n=10株植物）。
(g-h) 基因互補植物和去甲基化酶活性缺失互補植物的種子設置率（g）和I2/KI溶液中的花粉粒（h）（n = 3株植物）。
(i-k) 重組OsALKBH9蛋白在體外去甲基化含m6A的單鏈RNA（ssRNA）和聚腺苷酸+ RNA（poly A+ RNA），n = 3個生物學重復。(i) 體外去甲基化活性反應消化底物的LC-MS/MS色譜圖。(j, k) 使用ssRNA (j) 和poly A+ RNA (k) 作為底物，在體外去甲基化活性反應后的m6A變化。
(l) 通過LC-MS/MS在14天齡的WT、Osalkbh9-1和Osalkbh9-2莖中純化的mRNA中確定的m6A相對于腺苷的百分比（m6A/A比率）。n = 3個生物學重復。
（2）OsALKBH9是絨氈層PCD和花粉外壁積累所必需
圖2：OsALKBH9敲除導致絨氈層細胞降解延遲和花粉壁形態異常。
（a） 野生型和Osalkbh9-1突變體在花藥發育階段的7~11期的半薄切片。（b） 野生型和Osalkbh9-1花藥從第8~11階段的透射電子顯微照片。
（c） WT和Osalkbh9-1花藥7～11期的TUNEL分析。
E：表皮；En：內皮層；T：絨氈層；PMC：花粉母細胞；MC：減數分裂細胞；Msp：小孢子；dMsp：敗育的小孢子；Tds：四分體；Dy：二元細胞；FL：基座層；Te：外壁。
（3）OsALKBH9在花藥中高表達，主要定位于細胞質中
圖3：OsALKBH9在花藥中高表達，且主要定位于細胞質中。
（a） 通過qRT-PCR分析OsALKBH9在不同組織中的表達。在發育階段6~12收集花藥。其他組織在開花階段的植物中收獲。（b） 轉化了OsALKBH9啟動子驅動的β-葡萄糖醛酸酶（GUS）報告基因的轉基因花藥進行GUS染色，以可視化OsALKBH9表達。
（c） 亞細胞組分和免疫印跡分析。對Osalkbh9-1 OsALKBH9pro:：OsALKBH9CDS-FLAG轉化體的總蛋白、細胞質和細胞核富集級分的SDS-PAGE。UGPase（細胞質標記）和組蛋白H3（細胞核標記）分別進行western blot。
（d） 野生型花藥OsALKBH9轉錄本的原位雜交。
（e） OsALKBH9在本氏N.benthamiana葉表皮細胞中的亞細胞定位。
（4）OsALKBH9缺失影響與雄性育性和花粉外壁（exine）積累相關基因表達
圖4：OsALKBH9對雄性育性和花粉外壁積累相關基因表達。
（a） Osalkbh9-1突變體與野生型（WT）在花藥發育7~8階段和9~10階段的基因表達差異。通過維恩圖展示兩個階段共有和特有的差異表達基因。（b） 對第7~8階段和第9~10階段的共上調和共下調基因進行GO分析。左部分表示共上調基因，右半部分表示共下調基因。CC代表細胞組分（cell component），BP代表生物過程（biological process），MF代表分子功能（molecular function）。
（c） qRT-PCR檢測絨氈層發育和花粉外壁積累所需的基因。
（5）OsALKBH9基因功能喪失導致水稻轉錄組范圍內m6A修飾高甲基化
圖5：OsALKBH9基因功能喪失導致轉錄組范圍的m6A高甲基化。
(a) 火山圖結果顯示了Osalkbh9-1與野生型（WT）之間m6A修飾變化。(b) 累積分數圖和箱線圖顯示Osalkbh9-1和WT中m6A峰值的log2（富集倍數）。
(c) meta圖和雷達圖顯示Osalkbh9-1中鑒定出的m6A高甲基化峰值在指定mRNA片段的分布。
(d) 累積分數圖和箱線圖顯示Osalkbh9-1/WT中高甲基化、未變化甲基化和低甲基化峰值的基因表達模式。
(e) 對具有高甲基化峰值的基因進行GO分析。
(f) 基于前1000個峰值，使用HOMER軟件鑒定了依賴OsALKBH9的motif。
（6）OsALKBH9功能喪失導致TDR和GAMYB轉錄本中的m6A高甲基化
圖6：OsALKBH9依賴的m6A去甲基化調控花粉外壁積累。
（b） m6A-IP-qPCR結果顯示WT和Osalkbh9-1的第9~10階段花藥中的相對m6A水平。
（c） Osalkbh9-1 OsALKBH9pro:：OsALKBH9CDS FLAG小穗（第7~12階段花藥）中的RIP-qPCR顯示Osalkbh9直接與TDR和GAMYB轉錄本結合。
（d） WT和Osalkbh9-1小穗（花藥第7~12階段）中TDR和GAMYB的mRNA半衰期。
（e） OsALKBH9如何調控花粉外壁積累的工作模型。在野生型中，OsALKBH9去除TDR和GAMYB轉錄本上的m6A，降低其mRNA穩定性，確保花粉外壁適當積累。在Osalkbh9-1突變體中，TDR和GAMYB轉錄本中m6A高甲基化，促進其mRNA穩定性，激活參與花粉外壁積累的基因表達，導致花粉外壁過度積累和異常的外壁形態。
參考文獻：
Tang J, Lei D, Yang J, Chen S, Wang X, Huang X, Zhang S, Cai Z, Zhu S, Wan J, Jia G. OsALKBH9-mediated mA demethylation regulates tapetal PCD and pollen exine accumulation in rice. Plant Biotechnol J. 2024 Apr 17. doi: 10.1111/pbi.14354. Epub ahead of print. PMID: 38634166.
標簽：
RNA甲基化
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