評估t細胞對腫瘤相關抗原的特異性對于開發針對癌癥的個性化免疫療法至關重要。應用多參數表面等離子體共振(MP-SPR)技術表征腫瘤特異性CD8+ t細胞中t細胞受體(TCR)的相互作用。完整的活細胞被捕獲到由肽-主要組織相容性復合物(pMHC)功能化的人造細胞膜組成的仿生表面上。在4個不同的t細胞群體中完成了TCR和pMHC之間免疫突觸形成的實時親和分析。

簡介

       表面等離子體共振(SPR)是一種成熟的技術，用于實時和無標記地測量結合親和力和動力學。多參數表面等離子體共振(MP-SPR)儀器可以在寬角度范圍(40-78度)和多個波長范圍內進行測量，從而能夠評估從小分子到活細胞的各種相互作用。該技術可用于各種創新應用，例如表征與活細胞的相互作用(在傳感器上培養或在流動中捕獲)，以及確定生物層的厚度，包括脂質雙層和生物材料的構象變化。

       t細胞在人體免疫防御系統中發揮著重要作用，它們的激活引發了適應性免疫反應。t細胞在tcr與抗原肽相互作用時被激活，抗原肽由腫瘤細胞或抗原提呈細胞中的主要組織相容性復合體(MHC)呈現。腫瘤相關抗原特異性免疫細胞具有增強的抗腫瘤活性，為癌癥個性化免疫治療的發展奠定了基礎。這種創新療法旨在激活腫瘤特異性t細胞，幫助患者自身免疫系統攻擊癌細胞。成功的免疫治療需要可靠的TCR-pMHC結合參數來評估治療的特異性和安全性。

材料和方法

       使用MP-SPR Navi™210A VASA儀器進行測量，配備3種激光波長(每個流通道分別為670、785和980 nm)。Krebbs EDTA緩沖液流速為10 μl/min，測量溫度為16℃。

       基于細胞的檢測采用3種不同的傳感器格式(圖1):1. 金包覆聚乙二醇化烷硫醇(SAM -自組裝單層)；2. 負載脂質雙分子層(SLB)表面功能化SiO₂；3. 金包覆雜化雙層膜(HBM)。
所有3層都用生物素修飾，通過鏈霉親和素介導的結合，使生物素- pmhc復合物(裝載NY-ESO-I157−165抗原的HLA-A0201單體)固定化。以PEG-SAM表面為參照，以功能性SLB和HBM為仿生平面基質，測定t細胞受體結合情況。
         將人腫瘤特異性CD8+ t細胞以10² ~ 10⁵個/mL的細胞密度注射25 min后加載到細胞表面。注射后時間設置為10分鐘。連續注射增加細胞密度的4種不同細胞群，其中WT(野生型)，DMβ和V49I是不同的TCR變體，而T1φ作為陰性對照。
 
結果和討論

       基于脂質的傳感器表面在原位生成，并用專用的LayerSolver™軟件表征層的形成。SLB膜的厚度為5.65 nm, HBM層的厚度為1.95 nm下層的烷硫醇SAM，實際脂質亞層的厚度為2.88 nm。三種激光波長下SLB沉積的MP-SPR曲線及擬合如圖3所示。與聚乙二醇化的SAM表面相比，SLB和HBM表現出更好的細胞檢測靈敏度和更高的特異性細胞捕獲水平。
         對所有被測試的細胞群進行t細胞與pMHC功能化表面結合的實時動力學分析。二維結構解離動力學證明了三種腫瘤特異性CD8+ t細胞(WT, DMβ， V49I)的不同親和力。表1給出了兩種仿生表面上不同CD8+ t細胞變體的TCR與pMHC復合物結合的動力學值。獲得的數據與之前發表的計算機研究一致。DMβ t細胞特異性結合pMHC見圖4a。陰性對照T1φ t細胞未與pMHC結合(圖4b)。本文所描述的方法在t細胞群體的原位檢測和使用MP-SPR技術的結合親和力表征方面表現出出色的特異性和選擇性。
 
結論

      在本研究中，在傳感器表面生成仿生SLB和HBM層，并通過MP-SPR確定層的厚度。不同變體的腫瘤特異性CD8+ t細胞被成功捕獲到pMHC功能化的表面上，并測量了TCR對pMHC復合物的結構親和力。基于MPSPR的方法已被證明是測定膜受體抗腫瘤活性的有效工具，并可能加快癌癥免疫治療的發展步伐。BioNavis儀器可以在生理相關條件下、可控溫度(15 ~ 45℃)、靜態或動態流動條件下進行基于細胞的測量。因此，MP-SPR技術是基于活細胞的檢測的有力工具，對于開發新的細胞療法和生物材料至關重要。