實驗第一步，設計實驗！
不同的實驗方法需要設計的實驗分組也是不一樣噠，常見的幾種分組簡單整理如下哦~  


通常情況下，每組實驗至少需要設置 3-5 個平行，減少實驗誤差。

注意：以上是常規(guī)的分組思路，一些特殊實驗方法可能需要設置更多的分組 (如 LDH 細胞活力檢測)，實驗開始前詳細閱讀產品說明書或實驗 Protocol 是一個好習慣哦！

實驗設計好了，要開始實驗了，檢查一下我們的試劑/儀器準備好了嗎？

• 細胞系、基礎培養(yǎng)基、血清、抗生素，有條件的小伙伴也可以直接購買完全培養(yǎng)基哦~
• 96 孔板、細胞活力檢測試劑、無菌槍頭、無菌離心管、無菌水、無菌 PBS 等。
• 酶標儀。

一切準備就緒，我們來進行細胞復蘇吧~

 

【細胞復蘇】

取一支凍存細胞，在 37℃ 水浴中快速解凍。迅速轉移至 10 mL 完全培養(yǎng)基中，800 rpm 3 min 常溫離心收集細胞，細胞沉淀用完全培養(yǎng)基重懸，接種于培養(yǎng)皿中，并置于 37℃，5% CO₂ 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。(更多細胞復蘇 tips，請參考往期推文：干貨分享 | 細胞凍存與復蘇避坑指南)
注意: 不同凍存液細胞復蘇可能有差異，還是那句話，實驗開始前要詳細閱讀產品說明書或實驗 Protocol！
找一個合適的時間，看看我們的細胞是不是乖乖長大了？ 嗯~長得還不錯 ，進行預實驗來判斷一下最佳接種細胞量以及試劑使用量吧~

【對數期細胞收集】

細胞生長至對數期時收集細胞，使用細胞計數板計數。

【調整細胞密度】

使用 96 孔板時每孔加入 100 μL 細胞混懸液，設置 5-7 個細胞密度梯度，每個細胞密度設置 3-5 個復孔，確定檢測試劑所需最佳細胞密度。

啥都準備好了，廢話不說，我們上實驗！

【正式實驗】：根據預實驗結果接種細胞，置于 37℃，5% CO₂ 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

【配制藥物母液】：按照需要的實驗藥物濃度合理配制藥物母液，使用時稀釋母液即可。

【加藥】：每孔加入相同體積不同濃度的藥物，設置藥物處理時間為 12 h、24 h、36 h、48 h 等。

【檢測】：藥物處理后選擇合適的方法進行細胞活力檢測。


▐  1. CCK-8 檢測
基于 WST-8 檢測細胞增殖和細胞毒性的比色檢測法，主要用于細胞活性檢測。


檢測原理： WST-8 在電子耦合試劑存在的情況下，可被線粒體內的一些脫氫酶還原成 Formazan (橙黃色)。CCK-8 為預混溶液，即開即用。

 具體操作如下：

1） 96 孔板中每孔加入 10 μL 的 CCK-8 溶液 (注意不要產生氣泡)；

2） 培養(yǎng)箱培養(yǎng) 1-4 h (避免放在培養(yǎng)箱邊緣位置)；

3） 酶標儀測定在 450 nm 處的吸光度。

圖 1. KN93 和 Gemcitabine 對 CCLP1 細胞活力影響^[1]。

CCK-8 檢測細胞活力發(fā)現(xiàn) KN93 可以增強 Gemcitabine 對 CCLP1 的敏感性。

 

▐  2. Cell-ATP 檢測 

也叫做 CTG 檢測，基于高靈敏度生物發(fā)光檢測技術，通過對 ATP 進行定量以測定培養(yǎng)物中活細胞數目及細胞活力。



檢測原理：熒光素酶以熒光素、三磷酸腺苷 (ATP) 和 O₂ 為底物，在 Mg²⁺ 存在時，可將化學能轉化為光能。在熒光素酶催化的發(fā)光反應中，ATP 在一定的濃度范圍內，其濃度與發(fā)光強度呈線性關系。此方法不受化合物自發(fā)熒光的影響。

 具體操作如下：

1) 取出細胞培養(yǎng)板，室溫平衡 10 min;

2) 96 孔板中每孔直接加入 100 μL Cell-ATP 檢測試劑; 

3) 室溫振蕩混勻 2 min，以促進細胞充分裂解; 

4) 室溫孵育 10 min (可根據預實驗結果調整孵育時間)，使發(fā)光信號趨于穩(wěn)定; 

5) 使用具有檢測化學發(fā)光功能的多功能酶標儀進行化學發(fā)光測定 (檢測參數可根據儀器類型及檢測靈敏度適當調整)。

圖 2. SIPL1 對 TNBC 細胞活力的影響^[2]。

CCK-8 (a) 和 CTG 發(fā)光細胞活力測定 (b) 用指示載體轉導 BT-549 和 MDA-MB-231 細胞增殖能力的分析。

 

▐  3. LDH 檢測

乳酸脫氫酶 (Lactate dehydrogenase, LDH) 檢測試劑盒可以在細胞膜完整性喪失進而細胞漿內酶釋放時檢測細胞損傷。



檢測原理：在 LDH 的作用下，乳酸被氧化成丙酮酸 (Pyruvate), NADH 和 INT 被硫辛酰胺脫氫酶催化反應生成 NAD⁺ 和 Formazan。此方法與 CCK-8 聯(lián)用可以用于死、活細胞的同步檢測。

 具體操作如下：

注意：此方法需要設置高對照組，即在培養(yǎng)基中加入10 μL Lysis Solution。

• 間接檢測法：

1) 藥物處理細胞后，從 96 孔板每孔吸取 50 μL 上清液至新的 96 孔板中。而后在新的 96 孔板每孔中加入 50 μL Working Solution，震蕩混勻；

2) 室溫避光孵育 30 min；

3) 每孔加入 50 μL Stop Solution ，酶標儀測定 490 nm 處的吸光度。

• 直接檢測法：

1) 96 孔板每孔吸棄 50 μL 培養(yǎng)基上清，以剩余培養(yǎng)基及細胞作為檢測對象，每孔加入 50 μL Working Solution，震蕩混勻；

2) 室溫避光孵育 30 min；

3) 每孔加入 50 μL Stop Solution，酶標儀測定 490 nm 處的吸光度。

圖 3. OMVs 對 THP-1 細胞活力的影響^[3]。
LDH 檢測發(fā)現(xiàn)內源性 OMVs 不能誘導細胞焦亡及 Caspase-1 的活化。

 在細胞活力檢測實驗中，常見的數據分析方法是分析藥物處理前后 OD 值的變化，小 M 也為您整理了幾種方法~

▐  1. 細胞接種有什么要注意的嗎？
細胞接種時需要注意 96 孔板外圈不宜做實驗用途，可以用無菌水填滿，避免培養(yǎng)導致的邊緣效應。
▐  2. 對數期細胞怎么確定？
每種細胞的倍增時間不一樣，在養(yǎng)細胞初期，可以做細胞的生長曲線來確認細胞的倍增時間，根據細胞倍增時間推測達到對數生長期的時間。也可以在細胞匯合度達到 80% 左右時收集細胞進行接種。
▐  3. 接種細胞數量怎么確定？
接種的細胞用于后續(xù)實驗，可根據藥物培養(yǎng)時間及細胞翻倍速度來確定接種數量。
▐  4. 每次測定的數值不一樣，是什么原因？如何解決？
1）當在培養(yǎng)箱內培養(yǎng)時，培養(yǎng)板最外一圈的孔最容易干燥揮發(fā)，由于體積不準確而增加誤差。一般情況下，最外一圈的孔只加培養(yǎng)基或無菌水，不作為測定孔用。

2）有可能會因為 CCK-8 掛壁而產生誤差，建議在加入 CCK-8 后，輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻。

3）每孔的細胞數量過多或過少，請預先在 1,000～100,000 個/孔范圍內摸索條件。

▐  5. 哪些物質會影響 CCK-8 的測定？
當有還原性物質存在時會影響 CCK-8 的測定 (含有維生素 C 的 Glucose 等)。一般培養(yǎng)基中的酚紅或血清不影響測定。在有酚紅存在的情況下，會增加空白吸收，但不影響測定結果，扣除空白吸收即可。
▐  6. 在實驗中吸光度值太高，如果不能減少細胞數量，如何解決？
可以縮短加入 CCK-8 后的培養(yǎng)時間。例如：可以把加入 CCK-8 試劑后的培養(yǎng)時間由 2 h 縮短為 1 h。
▐  7. CCK-8 對于不同的細胞，靈敏度是否一樣？
不一樣，懸浮細胞與貼壁細胞相比較難染色。對于貼壁細胞，一般加入 CCK-8 培養(yǎng) 1-4 h 吸光度已經很高，但懸浮細胞則可能吸光度較低，可以通過延長孵育時間或增加細胞數量來解決。

▐  8. 應該每次做標準曲線嗎？
雖然細胞是一樣的，但是細胞的狀態(tài)不一定一樣，建議每次做標準曲線。如果試劑的批號不一樣，靈敏度可能會有輕微的差異，對于不同的批號建議分別做標準曲線。
▐  9. CCK-8 能否檢測細菌細胞？
可以檢測 E.coli，但不能檢測酵母細胞。具體操作：向 100 μL E.coli 培養(yǎng)液中加入10 μL CCK-8 溶液，并培養(yǎng) 1-4 h 或過夜，再進行吸光度測定。

 

[1] Fu Y, et al. Alpha5 nicotine acetylcholine receptor subunit promotes intrahepatic cholangiocarcinoma metastasis. Signal Transduct Target Ther. 2024 Mar 8;9(1):63.

[2] He J, et al. SIPL1, Regulated by MAZ, Promotes Tumor Progression and Predicts Poor Survival in Human Triple-Negative Breast Cancer. Front Oncol. 2021 Dec 17;11:766790. 

[3] Ye X, et al. Peptide MSI-1 inhibited MCR-1 and regulated outer membrane vesicles to combat immune evasion of Escherichia coli. Microb Biotechnol. 2023 Sep;16(9):1755-1773.