椎間盤疾病（IVDD）是最普遍的脊柱退行性疾病之一。由于長時間站立和肥胖導致的椎間盤（IVD）機械超負荷已被廣泛認為是 IVDD 的重要原因，而髓核（NP）承擔了 75% 的壓力。然而，機械超負荷誘導 IVDD 的具體機制尚未完全闡明。

谷胱甘肽過氧化酶4（GPX4）是主要的脂質過氧化物清除劑，在鐵死亡中起著關鍵的調節作用。據報道，由機械超負荷激活的 Piezo1 離子通道導致的鈣內流增強誘導 GPX4-調控的鐵死亡。已發現位于內質網膜（ER）的 Piezo1 的激活通過誘導ER的鈣離子釋放來增加細胞內游離鈣。然而，機械超負荷是否會同時激活位于質膜和內質網膜上的 Piezo1 離子通道以升高 NP  細胞內游離 Ca2+ 的水平，從而導致 GPX4 調控的鐵死亡仍有待確定。

硒蛋白K（SelK）是一種ER蛋白，已被證明與內質網應激和細胞抗氧化性有關。硒（Selenium）是一種必需的微量營養素，參與了抗氧化應激的保護。補充硒可以上調各種硒蛋白的表達，并且在濾泡輔助性T細胞中證明了 Selenium-GPX4 軸對鐵死亡的保護作用。然而，目前還沒有關于補硒是否可以通過上調 NP 細胞中的 SelK 和 GPX4 來減輕鐵死亡的報道。

最近，在山東大學齊魯醫院骨科、病理科及美國布萊根婦女醫院骨科的一項聯合研究中，計劃探索機械超負荷是否通過激活位于質膜和內質網膜上的 Piezo1 離子通道來阻礙 GPX4 的產生，從而導致 NP 細胞中的鐵死亡。在上述過程中，研究員將確定促進 ER 應激的因素以及ER應激在鐵死亡中的具體作用，此外，將驗證補充硒是否可以通過上調 GPX4 和 SelK 來減輕機械超負荷誘導的 NP 細胞鐵死亡。研究成果發表在 Cellular and Molecular Life Sciences 期刊題為“Selenium-SelK-GPX4 axis protects nucleus pulposus cells against mechanical overloading-induced ferroptosis and attenuates senescence of intervertebral disc”。
首先，為了研究 IVDD 期間 NP 組織中鐵死亡相關指標的變化，評估了退變椎間盤的 Pfirrmann 分級（圖1 A）。與早期階段相比，晚期退行性椎間盤的 NP 組織體積萎縮，彈性下降（圖1 B）。在退行性 NP 組織（IV級）中，GPX4 表達水平降低，但鐵死亡生物標志物 ACSL4 的表達水平升高（圖1 B）。

為了驗證 NP 中過度機械負荷與鐵死亡之間的關系，將大鼠 NP 細胞在 1 Hz、1 MPa 機械應力下培養 1 h。微陣列結果表明，與對照組相比，在機械應力刺激下，NP 細胞中 ECM 代謝紊亂，ACSL4 水平增加（圖1 C）。GO分析顯示，差異表達蛋白與細胞鈣離子穩態和對ER應激的反應高度相關，ER 成為最顯著富集的細胞成分之一（圖1 D）。對 ER 應激生物標志物 ATF6 進行 IHC，發現與 II 級相比，IV 級 NP 組織中 ATF6 顯著增加（圖1 E）。

此外，通過 TEM 研究了機械刺激對 NP 細胞的影響。與對照組相比，在機械超負荷組 ER 在結構上表現出異常腫脹，線粒體表現出線粒體膜增厚和線粒體萎縮等鐵死亡相關變化（圖1 G）。然后，Western blotting 和 qPCR 證實機械刺激降低了GPX4水平，增加了 ACSL4 水平和 ER 應激標志物 Bip 水平（圖1 H、I）。通過 GPX4 條件敲除小鼠證明了內源性 GPX4 在 IVD 中的生理作用（圖1 J）。

這些數據表明，過度的機械負荷會誘導 NP 細胞的鐵死亡和內質網應激。
接下來，實驗使用 SiPiezo1 和無鈣培養基來研究鐵死亡、ER 應激和機械超負荷之間的關聯（圖2 A、B）。有趣的是，清除細胞外 Ca2+ 減輕了由機械刺激誘導的細胞內游離 Ca2+ 水平的升高，而 Piezo1 的敲低具有更強的作用（圖2 C）。另一方面，Calnexin 水平與細胞內游離 Ca2+ 水平成反比，這表明過度的機械負荷通過 Piezo1 增加了細胞內游離 Ca2+ 水平（圖2 C-F）。同樣，Piezo1 的敲低減少了由機械刺激的 Bip 的上升，這種效果比僅清除細胞外 Ca2+ 要顯著（圖2 D-F）。

機械超負荷增加了 NP 細胞中 ROS 的產生并損害了線粒體的膜電位，同時敲低 Piezo1 并清除了細胞外 Ca2+ 逆轉了這些變化，但前者更有效（圖2 G-J）。敲低 Piezo1 上調了機械刺激誘導的 Col-2 水平的下降，而清除細胞外 Ca2+ 作用較弱（圖2 D-F）。

此外，建立 Piezo1-CKO 小鼠闡明 Piezo1 在 ER 應激中的作用。ATF6 免疫組化結果顯示，老齡 Piezo1-CKO 小鼠尾椎椎間盤 ER 應激水平顯著低于老齡 WT 小鼠（圖2 K、K）。在 Piezo1 被 SiPiezo1 敲低后，細胞內游離 Ca2+ 水平的升高被顯著逆轉，表明 Piezo1 的作用。

這些數據表明，機械超負荷通過位于 NP 細胞質膜和 ER 膜上的 Piezo1 離子通道來增加細胞內游離 Ca2+ 水平以誘導 ER 應激和鐵死亡。

據報道，抑制ER應激可以減輕結腸上皮細胞的鐵死亡，研究發現，Ca2+ 可能是 ER 應激和鐵死亡之間的關鍵節點。因此，利用 Ca2+-free 培養基和 ER 應激抑制劑 Bip 誘導因子X （BIX）進一步探討了 ER 應激、鐵死亡與細胞內游離 Ca2+ 之間的關聯。數據顯示，BIX 上調了 Bip 的水平，從而改善了 ER 應激并進一步降低了 ER 應激生物標志物 PERK 的水平，且細胞內游離 Ca2+ 的水平也降低。相應地，觀察到 Calnexin 水平與細胞內游離 Ca2+ 成反比，ACSL4 與之呈正比，GPX4 與之呈反比。此外，抑制ER應激進一步降低了 ROS 合成的升高，緩解了線粒體功能障礙，減少 ECM 分解代謝生物標志物 MMP-13 的產生，并促進 ECM 合成代謝生物標志物 Col-2 的分泌。這些數據表明，抑制ER應激通過減輕從 ER 流出的 Ca2+ 來減弱機械超負荷誘導的鐵死亡。 圖2    機械超負荷通過位于 NP 細胞質膜和 ER 膜上的 Piezo1 離子通道來增加細胞內游離 Ca2+ 水平以誘導 ER 應激和鐵死亡。

進一步的，實驗收集了不同等級的人類 NP 組織，并檢測了selenium 的濃度，發現退行性 NP 組織（IV級）中其濃度降低（圖3 A）。此外，在 500 kPa 或 1 MPa 的機械應力下培養大鼠 NP 細胞，無論是否添加 Se-Met，高應變負荷降低了 selenium 的濃度，但補充 Se-Met 逆轉了這種變化（圖3 B）。補充 Se-Met 還改善了 ECM 代謝紊亂，促進了細胞對鈣離子和 ER 應激的反應（圖3 C、D），并改善機械超負荷引起的 ER 腫脹和線粒體萎縮（圖3 E）。qPCR 和 Western blotting 顯示，高應變負荷降低了 GPX4 mRNA 和蛋白水平，而補充 Se-Met 促進了 GPX4 的表達（圖3 F、G）。Se-Met 還改善了機械超負荷誘導的 ROS 合成升高和線粒體功能障礙，并促進 Col-2 的表達，但當額外應用 GPX4 抑制劑 ML210 時，無法再觀察到這種現象（圖3 H、I、J）。Se-Met 還可減少 ADAMTS-5 和 MMP-13 的產生，促進 Aggrecan 和 Col-2 的分泌，而 ML210 則加重了 ECM 代謝紊亂（圖3 K-M）。這些數據表明，補充 Selenium 通過增強 GPX4 表達來保護 NP 細胞免受鐵死亡的影響。

為了探索 SelK 在機械超負荷誘導的 ER 應激中的作用，在大鼠 NP 細胞中敲低 SelK，添加 Se-Met，并對 NP 細胞進行機械超負荷刺激。qPCR 和 Western blotting 顯示，補充 Se-Met 組的 SelK 表達上調，ATF6 和 PERK 降低，而補充 Se-Met 的 SelK 敲低組則沒有出現這些結果。Se-Met 組的 GPX4 表達最高，ROS 合成減少，線粒體功能障礙得到改善，而 SelK 敲低后效果消失。此外，補充 Se-Met 可減少 ADAMTS-5 和 MMP-13 的產生，促進 Aggrecan 和 Col-2 的分泌，而敲低 SelK 會加重 ECM 代謝紊亂。這些數據表明，補充 Selenium 通過上調 SELK 表達來減輕 ER 應激。
最后，使用 WT 和 GPX4-CKO 小鼠來驗證 Selenium 在體內的作用，在12周齡的 WT 和 GPX4-CKO 小鼠中建立 IVDD 模型（圖4 A、B），收集小鼠的尾骨椎間盤組織，檢測  Selenium 的濃度。有趣的是，針刺降低了 Selenium 的濃度，但補充 Se-Met 改善了這種變化，但這種效果在 GPX4-CKO 小鼠中減弱（圖4 C）。MRI和顯微CT顯示，Se-Met 可緩解 WT 小鼠針刺誘導的 IVDD，然而，通過補充 Selenium，GPX4-CKO 小鼠的 IVDD 表型并未得到改善（圖4 D、E）。免疫組化染色顯示，補充 Se-Met 的 WT 和 GPX4-CKO 小鼠中 SelK 表達增加，ATF6 降低（圖4 F、G）。此外，在補充 Se-Met 的 WT 小鼠中觀察到 Col-2 的表達增加和 MMP-13 的表達降低，但在 GPX4-CKO 小鼠中沒有觀察到（圖4 F、G），這提示 GPX4 是 Se-Met 起作用的關鍵節點。這些數據表明，補充 Selenium 可緩解小鼠 IVDD 的進展。
綜上所述，該研究表明，在 NP 細胞中，當位于質膜和內質網膜上的 Piezo1 離子通道被機械超負荷激活時，細胞外鈣內流和細胞內鈣外流加強，導致細胞內鈣超載，從而導致 ER 應激，進一步加劇 ER 鈣外流，進而阻礙 GPX4 的產生和功能，誘導鐵死亡和 ECM 代謝紊亂。然而，補充 Selenium 可以上調 SelK 表達，緩解內質網應激，增強 GPX4 表達，減弱細胞氧化應激和鐵死亡。總之，鐵死亡在機械超負荷誘導的 IVDD 中起重要作用，補充 Selenium 對減輕鐵死亡，從而緩解 IVDD 具有重要意義，這可能為 IVDD 的潛在治療干預提供見解。

參考文獻：Jia C, Xiang Z, Zhang P, Liu L, Zhu X, Yu R, Liu Z, Wang S, Liu K, Wang Z, Vasilev K, Zhou S, Geng Z, Liu X, Zhao Y, Gao Y, Cheng L, Li Y. Selenium-SelK-GPX4 axis protects nucleus pulposus cells against mechanical overloading-induced ferroptosis and attenuates senescence of intervertebral disc. Cell Mol Life Sci. 2024 Jan 22;81(1)49. doi 10.1007s00018-023-05067-1. PMID 38252317; PMCID PMC10803455.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38252317
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