研究背景

當前，臨床對血栓栓塞性疾病的檢測通常依賴于間接方法，可能會造成診斷延遲并延誤及時治療。

利用分子成像技術開發出快速、特異性、直接檢測血栓的靶向分子標記物，迫在眉睫。FXIIa（凝血因子XIIa）是一種用于分子成像的潛在標記物，可以激活內源性凝血途徑和激肽-激酶系統，引起凝血和炎癥/免疫反應。

由于FXII廣泛存在于正常的止血過程中，其活化形式FXIIa可作為理想的分子靶點，用于血栓的診斷和評估溶栓治療效果。

2023年6月，《Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology》發表了澳大利亞貝克心臟和糖尿病研究所Peter Karlheinz研究團隊的最新研究成果。我們通過對文章的解讀介紹三維熒光斷層掃描技術在本研究（心血管疾病診斷探針）中的應用。

部分實驗結果 
 

3F7與NIR染料成功結合對血栓成像

室溫條件下，將3F7或非特異性的BM4（對照組）與過量的NIR熒光染料Cy7共孵育2小時，透析除去多余染料。為了驗證Cy7成功結合，使用SDS-PAGE得到約160 kDa的檢測帶（圖1A）。凝膠掃描結果（800 nm），3F7-NIR和BM4-NIR（結合Cy7“+”）均顯示出熒光信號，而僅3F7和BM4（未結合Cy7“-”）未發出熒光。抗體3F7與FXIIa具有特異性結合能力，作者接下來證明了3F7與近紅外染料的結合，不會阻礙其與FXIIa活性位點的結合。

利用凝血酶體外制備人源血栓，經3F7-NIR或BM4-NIR孵育后進行成像（圖1C）。與BM4-NIR孵育的血栓（對照組，1.61±0.33×107）相比，3F7-NIR組血栓熒光強度顯著增加（4.85±0.22×107，P=0.029），如圖1D。初步表明與熒光標記結合的3F7（3F7-NIR）對血栓診斷成像方法。

圖1. 熒光成像說明3F7和BM4與近紅外(NIR)染料成功結合，并成功靶向 FXIIa（凝血因子XIIa）對急性血栓進行成像。

靶向FXIIa對頸動脈血栓體內三維熒光斷層成像

為了研究3F7-NIR靶向結合FXIIa對體內急性血栓的3D-FLECT成像潛力，作者利用FeCl3誘導頸動脈血栓模型。此前已被證明，當3F7劑量高于5 µg/g BW時，可以防止小鼠血管栓塞。因此，作者選擇了較低劑量的3F7-NIR（2.5 µg/g BW），以確保3F7-NIR產生良好的成像信號時，最佳診斷血栓作用所需的低劑量。

在小鼠右頸動脈中誘發血栓，以左頸動脈作為健康對照。3F7-NIR及BM4-NIR在注射5分鐘后進行3D-FLECT成像。對采集到的熒光信號與CT成像數據融合進行3D重建。注射3F7-NIR（圖2A）的小鼠中，誘導血栓部位產生強熒光信號，BM4-NIR組的健康或損傷頸動脈中未觀察到熒光信號。

研究人員為了確認體內成像結果，將切除頸動脈進行離體成像（圖2B）。損傷頸動脈出現3F7-NIR的強熒光信號，但未受傷的健康血管無熒光，證明了3F7對血栓的選擇特異性靶向。

此外，與BM4-NIR組相比，3F7-NIR組的信號強度顯著增加（4.37±1.48 VS 1.21±0.77；P=0.002；圖2C)，對頸動脈切片熒光掃描與HE染色，確認3F7-NIR的熒光信號定位于血栓部位（圖2D）。

圖2.靶向血栓中FXIIa三維(3D)熒光發射計算機斷層掃描(FLECT)成像。

A.三維FLECT圖像展示近紅外（NIR）染料標記的3F7成功靶向結合體內的血栓。熒光和CT的雙模態成像在受傷的頸動脈上檢測到熒光信號。而小鼠注射的非結合BM4-NIR對照抗體時，未觀察到熒光信號；
B.IVIS圖像展示3F7-NIR特異性靶向損傷頸動脈，對健康血管沒有信號強度的變化；且都未觀察到對照組BM4-NIR相關的信號強度變化；
C.熒光強度定量分析，與對照組BM4-NIR（藍色）相比，3F7-NIR（紅色）注射后在損傷動脈的熒光強度顯著增加（平均輻射RE）；信號強度以其相應的健康血管作為對照歸一化；
D.損傷頸動脈切片的HE染色圖像以及近紅外熒光成像展示了3F7-NIR特異性結合在血管腔內的血栓，而BM4-NIR未觀察到熒光。

（FLECT CT-Ex/Em：730 nm / 803/60 nm）

技術要點介紹：可定量化的全角度三維小動物活體成像技術應用

FLECT/CT在文章中被應用于急性血栓形成的分子成像，通過結合熒光成像和計算機斷層掃描（CT），利用熒光標記的分子探針對血栓的特異性靶向結合，實現血栓精確定位的三維成像。該技術使用激光光源，不需要解剖，能夠檢測深層組織熒光信號，具有直觀、準確、高靈敏度成像的特點，為臨床前研究提供了可靠的依據。研究人員還可以利用FLECT/CT實現對血栓絕對定量分析，為心血管相關疾病的研究和治療提供重要的工具和方法。

原文信息：Activated Coagulation FXII: A Unique Target for In Vivo Molecular Imaging
作者：Xiaowei Wang*，Karlheinz Peter*
單位：Baker IDI Heart and Diabetes Institute，Melbourne
期刊：Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology
原文鏈接：https://doi.org/10.1161/ATVBAHA.122.318883

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