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應(yīng)用DAP-seq技術(shù)鑒定BcERF070下游靶基因揭示小白菜開花的分子機(jī)制

瀏覽次數(shù):886 發(fā)布日期:2024-2-29  來源:本站 僅供參考,謝絕轉(zhuǎn)載,否則責(zé)任自負(fù)
不結(jié)球白菜(Pak-choi),俗稱小白菜,是一種原產(chǎn)于中國的多葉狀蔬菜,已逐漸在世界范圍內(nèi)種植。小白菜易于早熟的特性,限制了生長發(fā)育和產(chǎn)量積累。因此,了解小白菜的開花調(diào)控機(jī)制對育種和產(chǎn)業(yè)具有重要意義。

2024年1月25日,南京農(nóng)業(yè)大學(xué)白菜系統(tǒng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的研究成果發(fā)表在Plant Physiology期刊上(影響因子7.4),題目為“ETHYLENE RESPONSE FACTOR 070 inhibits flowering in Pak-choi by indirectly impairing BcLEAFY expression”。該研究使用DNA親和純化測序(DAP-seq)技術(shù)鑒定了小白菜中BcERF070的下游靶基因,揭示了BcERF070響應(yīng)乙烯抑制小白菜開花的潛在分子機(jī)制。
 


1. BcERF070響應(yīng)乙烯,延緩小白菜開花
在外源乙烯處理?xiàng)l件下,小白菜開花延遲,蓮座葉數(shù)量增加,BcERF070的表達(dá)增加,并在處理2 h時達(dá)到峰值。此外,BcERF070的轉(zhuǎn)錄水平在整個營養(yǎng)生長期逐漸下降,并在生殖期達(dá)到最低。因此BcERF070參與了乙烯介導(dǎo)的開花調(diào)控。BcERF070基因沉默后,促進(jìn)小白菜提早開花,蓮座葉數(shù)量降低,BcFT誘導(dǎo)表達(dá)。因此,BcERF070在小白菜開花過程中起到負(fù)向調(diào)節(jié)作用。乙烯處理的沉默植株開花時間明顯提前,但晚于未處理組。由此表明BcERF070并不是參與小白菜開花調(diào)控的唯一途徑。
 
圖1. BcERF070基因沉默后促進(jìn)小白菜開花,并響應(yīng)乙烯。

2. BcERF070與BcMLP328相互作用
采用Y2H實(shí)驗(yàn)篩選到了BcERF070的互作蛋白BcMLP328,隨后使用BiFC、LCI、GST pull down、Co-IP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這一結(jié)果。然而,BcERF070和BcMLP328相互作用調(diào)控開花的機(jī)制尚不清楚。
 
圖2. BcERF070與BcMLP328相互作用。

3. BcMLP328促進(jìn)小白菜開花
乙烯處理小白菜促使BcMLP328的表達(dá)量降低。此外,BcMLP328僅在花器官中高表達(dá)。這表明BcMLP328可能與開花過程有關(guān)。隨后在小白菜中構(gòu)建了BcMLP328的過表達(dá)株系和沉默株系,通過表型觀察分析和開花相關(guān)基因(BcSOC1BcSPL15BcFTBcAP3BcTEM)表達(dá)量檢測,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明BcMLP328促進(jìn)小白菜開花。然而,BcMLP328促進(jìn)開花的機(jī)制尚不清楚。
 
圖3. BcMLP328響應(yīng)乙烯,并促進(jìn)小白菜開花。

4. BcMLP328增強(qiáng)了BcbHLH30對BcLFY的轉(zhuǎn)錄活性
采用Y2H實(shí)驗(yàn)篩選到了BcMLP328的互作蛋白BcbHLH30,隨后使用LCI、BiFC、Co-IP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了BcMLP328和BcbHLH30在體內(nèi)和體外的互作。隨后在小白菜中構(gòu)建BcbHLH30沉默株系,發(fā)現(xiàn)在沉默株系中開花延遲、蓮座葉增多、開花調(diào)控基因(BcFTBcLFY)表達(dá)量降低。這些結(jié)果表明,BcbHLH30正調(diào)控小白菜開花過程。
 
圖4. BcbHLH30與BcMLP328相互作用,促進(jìn)小白菜開花。

采用Y1H實(shí)驗(yàn)篩選BcbHLH30下游靶基因,發(fā)現(xiàn)BcbHLH30直接結(jié)合花相關(guān)基因BcLFY的啟動子,激活其表達(dá)。LUC實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這一結(jié)論。隨后,ChIP-qPCR實(shí)驗(yàn)檢測到在過表達(dá)BcbHLH30的小白菜株系中含有CATTTG-box的P2片段被顯著富集,EMSA實(shí)驗(yàn)證明了BcbHLH30與BcLFY啟動子區(qū)的CATTTG-box結(jié)合。共轉(zhuǎn)化煙草葉片實(shí)驗(yàn)表明BcMLP328增強(qiáng)了BcbHLH30對BcLFY的激活能力。
 
圖5. BcbHLH30與BcLFY啟動子結(jié)合并增強(qiáng)其表達(dá)。

5. BcERF070削弱了BcMLP328-BcbHLH30復(fù)合物對BcLFY的激活
為了驗(yàn)證BcERF070對于BcMLP328與BcbHLH30互作的影響,使用LCI實(shí)驗(yàn)證明,BcMLP328和BcbHLH30共轉(zhuǎn)染組中熒光明顯增強(qiáng),然而在加入BcERF070之后,熒光強(qiáng)度顯著降低。EMSA實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了這一結(jié)論。因此,BcERF070對BcMLP328與BcbHLH30的相互作用產(chǎn)生負(fù)向影響,這可能會降低BcMLP328-BcbHLH30復(fù)合物對BcLFY的轉(zhuǎn)錄激活。

推測BcERF070是通過破壞BcMLP328-BcbHLH30復(fù)合物進(jìn)而延遲開花,那么BcMLP328沉默株系、BcERF070BcMLP328雙沉默株系的開花時間理應(yīng)相似。但出乎意料的是,BcERF070BcMLP328雙沉默株系的開花時間早于BcMLP328沉默株系,蓮座葉也較少。由此推測BcERF070也可能通過破壞BcMLP328-BcbHLH30復(fù)合物以外的途徑來影響開花。
 
圖6. BcERF070削弱了BcMLP328-BcbHLH30復(fù)合物的激活活性。

6. BcERF070通過直接與BcBBX29啟動子結(jié)合增強(qiáng)其表達(dá)
采用DAP-seq分析可視化觀察到在Bcc29的啟動子區(qū)域存在較強(qiáng)的BcERF070結(jié)合峰,以及在BcBBX29的啟動子上可能存在結(jié)合區(qū)域。Y1H、Dual-LUC報告實(shí)驗(yàn)、EMSA實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了BcERF070與BcBBX29啟動子結(jié)合并激活其表達(dá)。與對照株系相比,BcBBX29沉默株系的開花時間更早、蓮座葉更少、BcFT表達(dá)更強(qiáng)。在過表達(dá)BcBBX29的擬南芥中觀察到開花時間更晚、蓮座葉更多。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,BcERF070通過直接激活BcBBX29的轉(zhuǎn)錄來延緩開花。
 
圖7. BcERF070直接與BcBBX29啟動子結(jié)合,激活其表達(dá)

圖8. 小白菜中BcERF070調(diào)控晚開花的分子機(jī)制模型。

在沒有乙烯的情況下,BcERF070的表達(dá)量較低,導(dǎo)致開花提前。然而,在乙烯存在的情況下,BcERF070的表達(dá)被誘導(dǎo),增加的BcERF070通過直接互作破壞BcMLP328-BcbHLH30復(fù)合物對BcLFY的激活,導(dǎo)致開花延遲;另外BcERF070還通過直接促進(jìn)開花抑制子BcBBX29的表達(dá)來抑制BcFT的表達(dá),進(jìn)而誘導(dǎo)晚開花。
 
小結(jié):該研究提出了BcERF070響應(yīng)乙烯調(diào)控小白菜開花的分子機(jī)制。外源乙烯處理增加了BcERF070的表達(dá),延緩了開花。BcERF070通過削弱小白菜中BcMLP328-BcbHLH30復(fù)合物對BcLFY的激活來延遲開花,此外BcERF070還直接促進(jìn)開花抑制子BcBBX29的表達(dá),從而降低BcFT的表達(dá),進(jìn)而延緩開花。本研究為乙烯介導(dǎo)的小白菜晚開花提供了見解,并為應(yīng)用乙烯調(diào)控作物生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。
 
文獻(xiàn)來源:Zhanghong Yu, Xiaoshan Chen, Yan Li, Sayyed Hamad Ahmad Shah, Dong Xiao, Jianjun Wang, Xilin Hou, Tongkun Liu, Ying Li. ETHYLENE RESPONSE FACTOR 070 inhibits flowering in Pak-choi by indirectly impairing BcLEAFY expression, Plant Physiology, 2024, kiae021, 
https://doi.org/10.1093/plphys/kiae021
發(fā)布者:藍(lán)景科信河北生物科技有限公司
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