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蛋白質印跡或免疫印跡的常見問題及其解決方案

瀏覽次數:808 發布日期:2024-1-15  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負

蛋白質印跡或免疫印跡 (Western blot,簡稱 WB) 是一種常見的實驗室方法,用于檢測蛋白質并評估其表達水平。根據其分子量和與特定抗體的免疫反應性來鑒定感興趣的蛋白質。蛋白質印跡由一系列相互關聯的步驟組成 (圖 1)[1]

 

圖 1. 蛋白質印跡相互關聯的步驟[1]。 

 (1) 將樣品 (通常是蛋白質混合物) 加載到凝膠上。Marker 標記包含各種已知分子量的預標記蛋白質,與蛋白質樣品一起加載到凝膠上作為尺寸參考。(2) 凝膠電泳用于根據蛋白質的分子量來分離蛋白質。(3) 將蛋白質轉移或“印跡”到膜上。(4) 封閉膜以減少非特異性結合,然后依次用特異性結合目標蛋白的一抗和二抗進行探測。后者結合一抗并攜帶允許隨后檢測的酶或熒光團。(5) 分別通過化學發光反應或熒光檢測信號。(6) 準備蛋白質印跡圖像以供發表。

由于該實驗時間長、細節多,從樣品制備到顯影,每個步驟中都可能存在問題,最后得到的條帶往往千奇百怪、不盡人意……在這篇推文中,我們將為您介紹一些常見的 WB 實驗問題以及相應的解決方案[2]。小 M 助您避免實驗中的各種困擾,快來看看吧!

 

▐ 1. 微笑條帶:

可能性原因:遷移過快、電泳緩沖液溫度偏高、蛋白質超載或孔內運行緩沖液不足。

建議:應降低遷移速度、預冷緩沖液、減少蛋白上樣量、緩沖液完全覆蓋孔,確保內室緩沖液不會泄露到外室[4][6]

▐ 2. 皺眉條帶:

可能性原因:裝置不合適,可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡,或者兩邊聚合不完全。

建議:可通過調整裝置來避免該問題。

▐ 3. 條帶拖尾:

可能性原因:樣品溶解不好;存在一定程度地蛋白降解;電泳液反復多次使用。

建議:樣品充分溶解混勻后上樣;盡量使用新鮮樣本;使用新鮮配制的電泳緩沖液。

▐ 4. 啞鈴狀不均勻條帶:

可能性原因:配置膠有問題,膠凝固后不均一;樣品可能含有過多雜質。

建議:重新配置膠,確保膠質量無問題來避免該現象出現;在樣品使用前離心。

▐ 5. 條帶粘連:

可能性原因:可能是上樣量太多,或者是制膠問題,分離膠和濃縮膠之間有間隙,樣品竄孔。

建議:可通過減少上樣量和提高配膠質量來避免。

▐ 6. 條帶空泡:

可能性原因:轉膜時膜上有氣泡

建議:確保在組裝“三明治”時,移除凝膠和印跡膜間的所有氣泡。

▐ 7. 背景有不均勻的黑色斑點:

可能性原因:封閉液未完全溶解,使不容顆粒附著在膜上從而導致發光時候膜上形成黑點;或抗體在膜上分布不均;

建議:封閉液一定要充分溶解,封閉結束之后要用 TBST 清洗三遍再加一抗;抗體孵育時保持搖動。

▐ 8. 條帶空斑:

可能性原因:目的蛋白條帶中間空白,周圍背景正常。該現象可能是一抗二抗濃度過高,促使底物過快消耗,從而導致在進行化學發光時,底物耗盡形成空斑。

建議:可減少蛋白上樣量;降低一抗和二抗濃度;或者稀釋顯影液。

通過本篇推文介紹,相信普通的難題已經難不倒你們了! 如果以上內容沒有解決您的問題,歡迎大家在下方留言,小 M 歡迎大家積極交流實驗中遇到的各種疑難問題~



Beta Actin Antibody HRP Conjugated

常用的內參抗體之一,可檢測 Beta Actin 總蛋白的內源水平。

alpha Tubulin Rabbit mAb

可檢測 alpha-tubulin 總蛋白的內源水平,并不會與重組 β-tubulin 蛋白發生交叉反應。 

c-Myc Rabbit mAb

該抗體可檢測 c-Myc 總蛋白的內源水平。 

HRP-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG H&L

鼠二抗,山羊來源的抗小鼠 IgG 抗體,用于小鼠背景下 WB、ELISA、IHC 實驗。 

HRP-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG H&L

兔二抗,山羊來源的抗兔 IgG 抗體,用于兔子背景下 WB、IHC-P、ELISA 實驗。 

Ultra High Sensitivity ECL Kit 

飛克級別抗原檢測,一抗稀釋比可達釋1:1000 至1:50000 倍。 

Protease Inhibitor Cocktail, mini-Tablet  (EDTA-Free)

在樣品制備、保存中可增加蛋白穩定性。 


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參考文獻:
[1] Kroon C, et.al. Blind spots on western blots: Assessment of common problems in western blot figures and methods reporting with recommendations to improve them. PLoS Biol. 2022 Sep 12;20(9):e3001783. 

[2] Cui Y. Optimization of blocking conditions for fluorescent Western blot. Anal Biochem. 2020 Mar 15;593:113598. 
[3] Begum H, et al. Western blotting: a powerful staple in scientific and biomedical research. Biotechniques. 2022 Jun;73(1):58-69. 
[4] Mary Johnson. Materials and Methods ,Western Blot - Protocol, Troubleshooting, and Survey Results on Instruments and Reagents. 
[5] Gilda JE, et al. Western Blotting Inaccuracies with Unverified Antibodies: Need for a Western Blotting Minimal Reporting Standard (WBMRS). PLoS One. 2015 Aug 19;10(8):e0135392. 
[6] Sule R, et al. Western blotting (immunoblotting): history, theory, uses, protocol and problems. Biotechniques. 2023 Sep;75(3):99-114.
發布者:上海皓元生物醫藥科技有限公司
聯系電話:021-58955995
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