文章題目：Transcriptional and Immune Landscape of Cardiac Sarcoidosis

中文題目：心臟結(jié)節(jié)病的轉(zhuǎn)錄和免疫圖譜

見刊時(shí)間：2022.09

期刊名稱：Circulation Research

影響因子：20.1

實(shí)驗(yàn)平臺：GeoMx DSP、snRNA-seq

DOI：10.1161/CIRCRESAHA.121.320449

 

研究背景

心臟受累是結(jié)節(jié)病患者死亡率的重要因素。盡管肉芽腫性炎癥是心臟結(jié)節(jié)病的一個(gè)標(biāo)志，但構(gòu)成肉芽腫精確的免疫細(xì)胞群仍不清楚。此外，尚不清楚心臟結(jié)節(jié)病與其他炎癥性心臟病相比的細(xì)胞和轉(zhuǎn)錄組學(xué)圖譜有何區(qū)別。

 

 研究方法 

研究者利用空間轉(zhuǎn)錄組（GeoMx DSP）和snRNA 測序來闡明心臟結(jié)節(jié)病的細(xì)胞和轉(zhuǎn)錄情況。使用DSP技術(shù)，研究者比較了人類心臟結(jié)節(jié)病（CS）、巨細(xì)胞心肌炎（GCM）和淋巴細(xì)胞性心肌炎中CD68+ 的免疫細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄譜。研究者對人類心臟結(jié)節(jié)病進(jìn)行了單核 RNA 測序，以鑒定免疫細(xì)胞類型和基因表達(dá)情況。使用多重免疫熒光染色，研究者驗(yàn)證了通過snRNA 測序鑒定的免疫細(xì)胞群，確定了它們的空間關(guān)系，并設(shè)計(jì)了一種免疫染色方法來區(qū)分心臟結(jié)節(jié)病和其他炎癥性心臟病。 

 

 技術(shù)路線

 

 主要研究結(jié)果 

1. CS中骨髓細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組特征

研究者使用GeoMx DSP技術(shù)來檢測CD68+細(xì)胞，以了解CS、GCM 和淋巴細(xì)胞性心肌炎中骨髓細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄差異。對于 CS 和 GCM 病例，選擇具有肉芽腫性炎癥的區(qū)域。對于淋巴細(xì)胞性心肌炎，選擇通過組織學(xué)和免疫熒光鑒定的具有密集淋巴組織細(xì)胞浸潤的區(qū)域。差異基因分析和KEGG富集分析顯示，在多個(gè)受試者和感興趣區(qū)域中都有轉(zhuǎn)錄變化。總之，與 GCM 和淋巴細(xì)胞性心肌炎相比，CS 中的骨髓細(xì)胞表現(xiàn)出獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄組譜。

圖1 心臟結(jié)節(jié)病中骨髓細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組特征

2. CS 炎癥的細(xì)胞群和轉(zhuǎn)錄組特征

研究者對 4 個(gè) CS 樣本分選的CD68+ 細(xì)胞進(jìn)行了 snRNA-seq ，共聚類出12種細(xì)胞類型，其中主要炎癥細(xì)胞類型是骨髓細(xì)胞和 NK-T 細(xì)胞。對NK-T 細(xì)胞進(jìn)行亞亞群分析，得到3 種細(xì)胞類型：NK 細(xì)胞、CD4+ T 細(xì)胞和 CD8+ T 細(xì)胞。人CS組織的免疫染色顯示，CD4+和CD8+T細(xì)胞主要位于肉芽腫的外圍。骨髓細(xì)胞亞亞群分析得到 6 個(gè)不同的骨髓細(xì)胞亞亞群，包括非經(jīng)典單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和4 組巨噬細(xì)胞（心臟駐留巨噬細(xì)胞和其它3個(gè)巨噬細(xì)胞群）。根據(jù) Palantir 偽時(shí)間軌跡分析顯示，這 6 個(gè)骨髓亞亞群表現(xiàn)出不同的細(xì)胞分化潛力，其中 Mac_res 和 Mac_GPNMB 群分化程度最高。

研究者之后使用多色免疫熒光揭示了 CS 中骨髓細(xì)胞類型的空間分布。Mac_GPNMB 亞簇代表多核巨細(xì)胞。數(shù)據(jù)也凸顯了 CS 中骨髓細(xì)胞群復(fù)雜的異質(zhì)性和空間分布。GPNMB染色存在于多核巨細(xì)胞中，表明Mac_GPNMB亞簇代表多核巨細(xì)胞。研究者將 GPNMB 鑒定為 CS 中多核巨細(xì)胞的分子標(biāo)記。

圖2 心臟結(jié)節(jié)病的細(xì)胞群和轉(zhuǎn)錄組特征

 

3. CS 中雷帕霉素途徑激活和巨噬細(xì)胞增殖活化

為了進(jìn)一步了解骨髓細(xì)胞在 CS 中的作用，研究者將 Mac_HLA-DR、Mac_SYTL3、Mac_GPNMB、DC_CD1C 和 mono_ FCGR3A與 Mac_res的轉(zhuǎn)錄表達(dá)進(jìn)行了比較。研究者鑒定了 621 個(gè)上調(diào)的差異表達(dá)基因，這些基因與多種免疫調(diào)節(jié)途徑相關(guān)，包括 mTOR（雷帕霉素的哺乳動(dòng)物靶標(biāo)）信號傳導(dǎo)。p-S6（磷酸化 S6 核糖體蛋白）是 mTOR 通路激活的標(biāo)志物。免疫染色顯示 14 個(gè) CS 樣本的肉芽腫中 p-S6 表達(dá)水平存在差異。通過 Ki67 染色評估，肉芽腫中 p-S6 染色的程度與細(xì)胞增殖相關(guān)。這些結(jié)果表明心臟結(jié)節(jié)肉芽腫由多種骨髓細(xì)胞類型組成。此外，研究者提出了mTOR激活可能調(diào)節(jié)特定巨噬細(xì)胞亞群(包括Mac_HLA-DR和Mac_SYTL3亞群)擴(kuò)張的可能性。

 

圖3 心臟結(jié)節(jié)病中的 mTOR（哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶點(diǎn)）通路激活和巨噬細(xì)胞增殖

 

4. 多核巨細(xì)胞顯示出特定的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

為了了解 Mac_HLA-DR、Mac_SYTL3、Mac_GPNMB、DC_CD1C 和 mono_ FCGR3A 到 Mac_res 簇的功能，研究者進(jìn)行了KEGG分析。Mac_GPNMB 簇（多核巨細(xì)胞）顯示出溶酶體和 PPAR 途徑的顯著富集。其他亞簇顯示出一些重疊的特征。

研究者進(jìn)一步對骨髓細(xì)胞群進(jìn)行了基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析。Mac_GPNMB（多核巨細(xì)胞）中富集了多種調(diào)節(jié)子及其轉(zhuǎn)錄因子，包括 MITF（小眼相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子）、TFEC（轉(zhuǎn)錄因子 EC）、ARID5B（富含 AT 的相互作用結(jié)構(gòu)域蛋白 5B）和 NR1H3（肝臟X受體α）。TF調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析預(yù)測了Mac_GPNMB亞簇中這些TF調(diào)控的幾個(gè)下游基因。研究者也驗(yàn)證了MITF轉(zhuǎn)錄在Mac_GPNMB中的作用。

接下來，研究者研究了巨細(xì)胞（Mac_GPNMB）、單核細(xì)胞（Mono_ FCGR3A）、其他巨噬細(xì)胞（Mac_res、Mac_HLA-DR、Mac_SYTL3）、樹突狀細(xì)胞（DC_CD1C）、T細(xì)胞（T_CD4、T_CD8）和NK細(xì)胞之間可能的細(xì)胞間通訊。該分析預(yù)測了多核巨細(xì)胞和其他骨髓細(xì)胞之間的細(xì)胞間相互作用。研究者用擬時(shí)序分析探討了了多核巨細(xì)胞的起源。結(jié)果表明，CS（Mac_GPNMB）中的多核巨細(xì)胞處于相對分化的狀態(tài)。

 

圖4 多核巨細(xì)胞顯示出特定的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

 

5. Mac_GPNMB是CS組中特殊存在的細(xì)胞亞群

為了證明 Mac_ GPNMB 亞群（多核巨細(xì)胞群）在 CS 中特異性存在或富集，研究者比較了來自非患病人類心臟（供體心臟）、人ICM 和人NICM 的 snRNA-seq 數(shù)據(jù)。研究者觀察到跨數(shù)據(jù)集的 Mac_res 細(xì)胞之間存在很強(qiáng)的對應(yīng)性，但 Mac_GPNMB、Mac_HLA-DR 和 Mac_SYTL3 的轉(zhuǎn)錄特征在 ICM、NICM 和供體骨髓細(xì)胞中表達(dá)較弱。此外，與 CS 相比，GPNMB 表達(dá)在 ICM、NICM 和供體骨髓細(xì)胞中表達(dá)較弱，并且不集中在 Mac_GPNMB 簇中。這些數(shù)據(jù)支持Mac_GPNMB集群特定在CS組中存在。

研究者確定了 CS 肉芽腫的特定染色模式：GPNMB+ 多核巨細(xì)胞被HLA-DR 陽性上皮樣組織細(xì)胞包圍。接下來，研究者探討了這些特征在區(qū)分各種心臟病方面的臨床效用。因此， CS 中 GPNMB+  和 HLA-DR+  巨噬細(xì)胞的獨(dú)特組織特征，可能為區(qū)分 CS 與其他形式的心肌炎（包括 GCM）提供診斷實(shí)用性。

 

圖5 將骨髓亞亞群映射到數(shù)據(jù)集的數(shù)據(jù)中

 

圖6 GPNMB（跨膜糖蛋白 NMB）和 HLA-DR（人類白細(xì)胞抗原-DR 同種型）免疫染色可區(qū)分心臟結(jié)節(jié)病和其他形式的心肌炎

 

 研究意義 

研究者通過剖析 CS 的細(xì)胞群和轉(zhuǎn)錄特征，闡明了肉芽腫性炎癥區(qū)域內(nèi)存在多種不同的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞群。CS 中的多核巨細(xì)胞表達(dá) GPNMB，并被由 HLA-DR+ 和 SYTL3+ 巨噬細(xì)胞組成的上皮樣組織細(xì)胞包圍，顯示出強(qiáng)大的 mTOR 激活。在診斷上，研究者發(fā)現(xiàn) GPMNB 和 HLA-DR 染色可能提供一種區(qū)分 CS 與其他炎癥性心肌病的方法。

 

參考文獻(xiàn)：

Liu J, Ma P, Lai L, Villanueva A, Koenig A, Bean GR, Bowles DE, Glass C, Watson M, Lavine KJ, Lin CY. Transcriptional and Immune Landscape of Cardiac Sarcoidosis. Circ Res. 2022 Sep 30;131(8):654-669. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.121.320449. Epub 2022 Sep 16. PMID: 36111531; PMCID: PMC9514756.