體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗常見問題與解答
—熱點問題—

第一題    細胞被“黑膠蟲”污染了該如何處理？
如果培養的細胞被“黑膠蟲”污染，需先去評估污染的嚴重程度。如果污染不嚴重，可選用市售的“黑膠蟲”清除試劑進行處理；如果污染較嚴重，建議直接丟棄該細胞，分析造成“黑膠蟲”污染的原因并進行治理。

第二題    CHL細胞為試驗系統，細胞準備時推薦的接種密度是多大？接種后培養多久可以開始染毒？
本公司使用T25瓶進行試驗，接種密度為6~9×10^4/mL，接種量為5mL，即每瓶細胞量是3×10^5個~4.5×10^5個。一般情況下，接種后24h左右細胞的融合率可達到80%即可進行染毒，如果融合率不夠，也可以繼續培養直至滿足試驗需求。

第三題    一般如何確定秋水仙素的濃度和處理時間啊？
秋水仙素劑量大，則作用時間短；秋水仙素劑量小，則適當延長作用時間。本公司使用的秋水仙素濃度是1μg/mL，4h。

第四題    秋水仙素工作的機理是什么？
秋水仙素可以抑制紡錘體的形成，導致紡錘絲無法捕捉到著絲粒而造成染色體不能向細胞兩極移動。同時，秋水仙素處理后，染色體將會不能排列在赤道板，所以在細胞中會散亂分布。

第五題    細胞收集量少是什么原因導致的？如何優化？
細胞收集量少的原因主要有以下幾點：
（1）酶消化過程消化不干凈；
（2）離心速度過低，細胞不能沉淀，導致細胞丟失；
（3）鋪板細胞量不夠；
（4）樣品對細胞有毒性，細胞死亡。

優化策略：
（1）酶消化過程需于顯微鏡下觀察，確保消化完全；
（2）適宜的離心條件，通常250g，5min;
（3）細胞懸液需混合均勻，必要時多次計數；
（4）如有需求，請于正式試驗前開展預試驗。

第六題    低滲目的是什么？有什么注意事項？
在低滲環境中，細胞易吸水膨脹，染色體鋪展，以便能在一個平面上觀察所有染色體形態，為后續染色做準備。在低滲過程中我們需要注意以下幾點：

（1）低滲時間。低滲時間過長，可引起細胞破裂，染色體丟失；低滲時間不足，細胞膨脹度不夠，染色體聚集，分散不好，不利于閱片。本公司低滲是使用0.075mol/L的氯化鉀溶液37℃水浴30~40min。
（2） 細胞操作需輕柔。低滲后的細胞會脹大，通透性增強，細胞操作過程一定要輕柔，以防細胞破裂。
（3）離心條件需適合。低滲后細胞膨脹，離心力過高，細胞容易破裂，導致染色體丟失；離心力過低，細胞不能沉淀，收集不到細胞。

第七題    細胞在固定過程中丟失是什么原因導致的？
細胞在固定過程中丟失可能是因為離心速度過低，細胞不能沉淀或沉淀不夠，在更換固定液的過程中導致細胞丟失。

第八題    每次固定的時間是多久？固定幾次比較合適？
本公司使用的是預固定加重復固定的方法。預固定在低滲結束前進行，一般3~5min，步驟雖簡單卻不能省略，可有效預防細胞因加入大量的固定液而凝結成塊。固定步驟共重復3次，一般30±5min。

第九題    玻片干燥怎么操作？
可于室溫下自然干燥，也可于37℃干燥箱中烘干。

第十題    使用吉姆薩染液同樣條件下染片，為什么會出現有的片子是藍色的，有的是紅色的？
根本原因是因為染色過程中pH的變化。吉姆薩染液由天青，伊紅組成，所帶電荷隨溶液PH而定。在偏酸性環境中下在電荷增多易與伊紅結合染色偏紅；在偏堿性環境中負電荷增多,易與美藍或天青結合,染色偏藍。

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