NovaSeq™ X系列使用XLEAP-SBS化學(xué)技術(shù)，該技術(shù)是我們成熟的因美納邊合成邊測(cè)序(SBS)化學(xué)技術(shù)的升級(jí)版，速度更快、保真度更高、性能更可靠。這一革新性的技術(shù)使得新一代測(cè)序儀的通量和生產(chǎn)力獲得提升，從而改變了大規(guī)模測(cè)序的經(jīng)濟(jì)效益。本文中，我們展示了NovaSeq™ X系列在五大核心應(yīng)用方面的提供的數(shù)據(jù)質(zhì)量達(dá)到或超過(guò)了NovaSeq™ 6000基因測(cè)序儀，這些核心應(yīng)用包括全基因組測(cè)序、全外顯子組測(cè)序、全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、甲基化 測(cè)序和單細(xì)胞多組學(xué)測(cè)序。
 

01

使用TruSeq PCR-Free Prep kit (因美納：貨號(hào)20015963)從NA12878 基因組 gDNA(Coriell醫(yī)學(xué)研究所)樣本中制備全基因組文庫(kù)。使用 DRAGEN Germline pipeline v4.1 分析流程進(jìn)行二級(jí)數(shù)據(jù)分析。將測(cè)序數(shù)據(jù)降采樣至 30×覆蓋度以比較NovaSeq X Plus和 NovaSeq 6000 基因測(cè)序儀之間的變異檢出性能。

評(píng)估了全基因組測(cè)序(WGS)分析指標(biāo)，包括單核苷酸變異(SNV)和片段插入缺失(INDEL)的準(zhǔn)確率和查全率。NovaSeq X Plus和NovaSeq 6000基因測(cè)序儀均可提供高質(zhì)量的數(shù)據(jù)和高度準(zhǔn)確的變異檢出(表1、表2)。這些數(shù)據(jù)表明，NovaSeq X 系列的WGS結(jié)果達(dá)到或超過(guò)了 NovaSeq 6000基因測(cè)序儀的性能。
 

02

使用 Illumina DNA Prep with Enrichment, (S) Tagmentation (因美納：貨號(hào)2002554)從 NA12878基因組gDNA (Coriell醫(yī)學(xué)研究所)樣本中制備外顯子組文庫(kù)，再由Twist Comprehensive Exome Panel(Twist Bioscience：貨號(hào)102033)捕獲其中的目標(biāo)基因組區(qū)域。使用 DRAGEN Enrichment pipeline v4.0.3 分析流程進(jìn)行二級(jí)數(shù)據(jù)分析。根據(jù)Genome in A Bottle(GIAB) v3.3.2 真值集和hg19-alt-aware參考基因組評(píng)估變異檢出的準(zhǔn)確度。將測(cè)序數(shù)據(jù)降采樣至每個(gè)樣本30M reads以比較NovaSeq X Plus和NovaSeq 6000基因測(cè)序儀之間的變異檢出性能。
 

對(duì)全外顯子組測(cè)序(WES)的初級(jí)和二級(jí)分析指標(biāo)進(jìn)行了評(píng)估，包括質(zhì)量分值、錯(cuò)誤率、常染色體基因檢出率、匹配reads百分比、覆蓋均一性以及 SNV和插入缺失的準(zhǔn)確率和查全率。NovaSeq X Plus和NovaSeq 6000基因測(cè)序儀均可提供高質(zhì)量的數(shù)據(jù)和高度準(zhǔn)確的變異檢出(表3、表4)。這些數(shù)據(jù)表明NovaSeq X系列的WES結(jié)果與NovaSeq 6000基因測(cè)序儀的性能相當(dāng)。

03

使用 Illumina Stranded Total RNA Prep with Ribo-Zero Plus (因美納：貨號(hào)20040529)和 Illumina Stranded mRNA Prep(因美納：貨號(hào)20040534)從白血病細(xì)胞系RNA: HL-60(Thermo Fisher Scientific：貨號(hào)AM7836)和K562(BioChain：貨號(hào)R1255820-50)以及乳腺癌細(xì)胞系RNA: MCF7(BioChain：貨號(hào) R1255830-50)中制備總 RNA 和信使 RNA(mRNA)文庫(kù)。使用 DRAGEN RNA pipeline v4.1 分析流程進(jìn)行二級(jí)數(shù)據(jù)分析。所有樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)均降采樣至 10M reads以比較基因表達(dá)數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)與基因組參照序列聯(lián)盟的人類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)參考基因組 GRCh38(hg38 組裝)進(jìn)行比對(duì)。
 

 

圖1：全轉(zhuǎn)錄組總RNA-Seq 相關(guān)性一一癌細(xì)胞系: HL-60、K562和 MCF7 的每百萬(wàn)轉(zhuǎn)錄本(TPM)。
 

圖 2：全轉(zhuǎn)錄組 mRNA-Seq 相關(guān)性一一癌細(xì)胞系：HL-60、K562 和 MCF7 的每百萬(wàn)轉(zhuǎn)錄本(TPM)。

NovaSeq X Plus 和NovaSeq 6000基因測(cè)序儀的總 RNA-Seq數(shù)據(jù)質(zhì)量(表5)和mRNA-Seq 數(shù)據(jù)質(zhì)量(表6)均高于已公布的規(guī)格。對(duì)于總RNA-Seq(圖1)和mRNA-Seq(圖2)，兩個(gè)平臺(tái)的轉(zhuǎn)錄本定量結(jié)果具有出色的一致性(R2 > 0.99)。這些數(shù)據(jù)表明，在NovaSeq X 系列上進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序產(chǎn)生的數(shù)據(jù)質(zhì)量達(dá)到或超過(guò)了NovaSeq 6000基因測(cè)序儀的性能。

04

圖3：全基因組甲基化測(cè)序——NovaSeq X Plus基因測(cè)序儀和NovaSeq 6000 基因測(cè)序儀的Zymo-Seq WGBS 結(jié)果顯示 (A) 甲基化胞嘧啶百分比和 (B) 比對(duì)效率。
 

圖4：全基因組甲基化測(cè)序的基因組覆蓋度——NovaSeq X Plus 基因測(cè)序儀和NovaSeq 6000 基因測(cè)序儀的Zymo-Seq WGBS 結(jié)果顯示了CpG 覆蓋度分布。

對(duì)全基因組甲基化指標(biāo)進(jìn)行評(píng)估，從而比較NovaSeq X系列和NovaSeq 6000基因測(cè)序儀的性能。NovaSeq X Plus基因測(cè)序儀和NovaSeq 6000基因測(cè)序儀均展示了甲基化胞嘧啶 百分比的定量數(shù)據(jù)，與基于產(chǎn)品文檔的預(yù)期一致(圖3A)。在NovaSeq X Plus基因測(cè)序儀上檢測(cè)到匹配文庫(kù)的比對(duì)效率更高(圖3B)。全基因組覆蓋度分布圖顯示，NovaSeq X Plus基因 測(cè)序儀和NovaSeq 6000基因測(cè)序儀的結(jié)果相當(dāng)，但高覆蓋度 CpG(> 50×)有所增加(圖4)。在文庫(kù)制備過(guò)程中，亞硫酸氫鹽或酶促轉(zhuǎn)化會(huì)將未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶。這會(huì)導(dǎo)致文庫(kù)不平衡，這種不平衡歷來(lái)都是測(cè)序要面對(duì)的難題，并且通常需要高比例(> 5%)的 PhiX 來(lái)提高堿基多樣性。在NovaSeq X系列上，僅需低比例(1%) 的PhiX即可實(shí)現(xiàn)高質(zhì)量的測(cè)序運(yùn)行(表7)。

05

Chromium Single Cell Multiome ATAC+基因表達(dá)能以單細(xì)胞分辨率聯(lián)合讀出基因表達(dá)和表觀遺傳學(xué)特征。用于單細(xì)胞RNA 測(cè)序(scRNA-Seq)和轉(zhuǎn)座酶可及性染色質(zhì)單細(xì)胞檢測(cè)(scATAC-Seq)的樣本是從AllCells公司提供的健康男性供體(年齡小于35歲)的冷凍保存人外周血單核細(xì)胞(PBMC)中聯(lián)合制備的。按照10x Genomics經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的實(shí)驗(yàn)方案 —— 單細(xì)胞多組學(xué)ATAC +基因表達(dá)測(cè)序的細(xì)胞核分離(CG000365 Rev A)中的描述分離細(xì)胞核。配對(duì)的 scRNA-Seq和scATAC-Seq文庫(kù)是從分離的細(xì)胞核中生成的，如 Chromium Next GEM單細(xì)胞多組學(xué)ATAC +基因表達(dá)用戶(hù)指南(CG000338 Rev B)中所述。使用Cell Ranger ARC analysis pipeline v2.0(10x Genomics)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析以計(jì)算單細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄本和染色質(zhì)可及性峰值。
 

圖 5: 單細(xì)胞多組學(xué)基因表達(dá)一在NovaSeq X Plus 基因測(cè)序儀(藍(lán)色)和 NovaSeq 6000 基因測(cè)序儀 (紅色) 上測(cè)序的 scRNA-Seq文庫(kù)的 t-SNE 圖。

圖6：?jiǎn)渭?xì)胞多組學(xué)染色質(zhì)可及性——在NovaSeq X Plus 基因測(cè)序儀(藍(lán)色) 和NovaSeq 6000 基因測(cè)序儀 (紅色) 上測(cè)序的 scATAC-Seq文庫(kù)的t-SNE圖。

評(píng)估了單細(xì)胞多組學(xué)檢測(cè)的性能指標(biāo)，包括用于測(cè)量基因表達(dá)的 scRNA-Seq和用于測(cè)量染色質(zhì)可及性的scATAC-Seq。NovaSeq X Plus和NovaSeq 6000基因測(cè)序儀的數(shù)據(jù)質(zhì)量超過(guò)了已公布的規(guī)格要求(表8、表9)。scRNA-Seq基因表達(dá)(圖5)和scATAC-Seq染色質(zhì)可及性(圖6)的t-SNE圖顯示NovaSeq X Plus基因測(cè)序儀和NovaSeq 6000基因測(cè)序儀之間具有良好的相關(guān)性。

僅供研究使用，不得用于診斷。