文獻科普：m6A甲基化修飾在神經元發育和成體神經形成中的作用研究
近年來研究發現m6A修飾在哺乳動物神經系統的mRNA中普遍存在，并在胚胎期和產后神經元發育過程中表現出動態特征。浙江大學醫學院李學坤教授團隊多組學聯合分析揭示了m6A修飾通過調節組蛋白甲基轉移酶Ezh2來調控神經形成和神經元發育，進一步驗證了m6A甲基化修飾在神經元發育和成體神經形成中的作用。
標題：m6A Regulates Neurogenesis and Neuronal Development by Modulating Histone Methyltransferase Ezh2（m6A修飾通過調節組蛋白甲基轉移酶Ezh2來調控神經形成和神經元發育）
時間：2019.4
期刊：Genomics Proteomics Bioinformatics
影響因子：IF 7.691
技術平臺：MeRIP-seq、m6A MeRIP-qPCR、RNA-seq、ChIP
摘要：
m6A甲基化酶由Mettl3和Mettl14組成，是mRNA中最豐富的RNA修飾，參與多種生物過程。然而，m6A修飾在調控神經元發育和成體神經形成中的作用和確切機制尚不清楚。在本研究種，作者檢測了Mettl3在小鼠神經元發育和成體神經形成中的功能，結果發現Mettl3沉默導致成體神經干細胞（adult neural stem cells，ANSC）中m6A修飾水平顯著下調，并影響了細胞增殖。Mettl3沉默不僅影響神經元發育，使ANSC分化更傾向于膠質細胞系，而且還影響了新生神經元的形態成熟。m6A-seq（MeRIP-seq）測序分析結果顯示m6A修飾主要富集在與神經形成和神經元發育相關的轉錄本中。從機制上講，m6A修飾存在于組蛋白甲基轉移酶Ezh2的轉錄本上，mettl3沉默導致Ezh2蛋白表達水平下調，ChIP實驗證明H3K27me3水平下調。免疫熒光觀察發現，mettl3沉默引起的神經細胞增殖和分化缺陷可被Ezh2過表達所回復。總之，研究結果揭示了RNA修飾和組蛋白修飾之間的串擾，并表明Mettl3介導的m6A修飾通過調節組蛋白甲基轉移酶Ezh2表達在調控成體神經形成和神經元發育中發揮重要作用。
實驗方法和流程設計
結果
（1）小鼠神經干細胞發育中mettl3的表達動態
（A-D）神經干細胞增殖和分化中mettl3表達動態的免疫熒光觀察
（E-F）Western blot檢測m6A甲基化酶mettl3和mettl14在增殖和分化中的變化
（I）Dot blot和MS檢測增殖和分化過程中總體m6A修飾水平的變化
（2）m6A甲基化酶mettl3調控神經干細胞增殖
（E-G）免疫熒光觀察：mettl3沉默影響了細胞增殖
（H）RT-PCR檢測mettl3沉默導致多種細胞周期蛋白mRNA水平下調
（I-K）流式細胞術分析沉默后細胞周期狀態發生改變
（3）m6A甲基化酶mettl3調控神經干細胞分化和發育
（A-E）免疫熒光觀察：mettl3沉默和過表達對神經干細胞分化的影響（Tuj1為神經元細胞標志物，GFAP為星形膠質細胞標志物）
（F-G）Western blot：mettl3沉默和過表達對神經干細胞分化的影響
（H-L）Sholl分析檢測mettl3沉默和過表達對新生神經元細胞和海馬神經元的影響
（I-K）原位電穿孔圖像分析mettl3沉默對神經元的數量和長度的影響
（4）神經干細胞從增殖到分化的m6A修飾動態
（A-B）增殖和分化細胞的m6A修飾在轉錄本上的分布比較
（C）增殖和分化細胞的m6A修飾區域motif分析
（D）增殖和分化細胞中m6A修飾基因的重疊分析
（E-G）共有基因和獨有基因的GO功能富集分析
（H）m6A修飾基因和差異表達基因的重疊分析
（I）具有m6A修飾的差異表達基因的GO分析
（J）增殖和分化細胞中幾個差異m6A修飾基因的IGV展示
（5）mettl3通過m6A修飾調節基因表達，進而影響神經細胞增殖
（C）組學關聯分析火山圖（九象限圖的另一個版本）
（D-E）mettl3沉默后有m6A修飾的上調和下調差異表達基因的GO分析
（F）四個與神經發育功能相關基因在mettl3沉默后m6A修飾水平降低
（G）m6A修飾的差異表達基因功能網絡
（6）Ezh2受Mettl3調控，可挽救Mettl3基因下調引起的神經元發育和神經發生缺陷
（A-C）mettl3沉默導致Ezh2蛋白表達水平下調，CHIP實驗證明H3K27me3水平下調。
（D-E）mettl3沉默和Ezh2 m6A修飾區引入突變，都不影響Ezh2的mRNA水平
（F-I）免疫熒光觀察發現，mettl3沉默引起的神經細胞增殖和分化缺陷可被Ezh2過表達所回復
（D）Ezh2過表達挽救了受損的新生神經元的形態成熟
參考文獻：https://doi.org/10.1016/j.gpb.2018.12.007
標題：m6A Regulates Neurogenesis and Neuronal Development by Modulating Histone Methyltransferase Ezh2（m6A修飾通過調節組蛋白甲基轉移酶Ezh2來調控神經形成和神經元發育）
時間：2019.4
期刊：Genomics Proteomics Bioinformatics
影響因子：IF 7.691
技術平臺：MeRIP-seq、m6A MeRIP-qPCR、RNA-seq、ChIP
摘要：
m6A甲基化酶由Mettl3和Mettl14組成，是mRNA中最豐富的RNA修飾，參與多種生物過程。然而，m6A修飾在調控神經元發育和成體神經形成中的作用和確切機制尚不清楚。在本研究種，作者檢測了Mettl3在小鼠神經元發育和成體神經形成中的功能，結果發現Mettl3沉默導致成體神經干細胞（adult neural stem cells，ANSC）中m6A修飾水平顯著下調，并影響了細胞增殖。Mettl3沉默不僅影響神經元發育，使ANSC分化更傾向于膠質細胞系，而且還影響了新生神經元的形態成熟。m6A-seq（MeRIP-seq）測序分析結果顯示m6A修飾主要富集在與神經形成和神經元發育相關的轉錄本中。從機制上講，m6A修飾存在于組蛋白甲基轉移酶Ezh2的轉錄本上，mettl3沉默導致Ezh2蛋白表達水平下調，ChIP實驗證明H3K27me3水平下調。免疫熒光觀察發現，mettl3沉默引起的神經細胞增殖和分化缺陷可被Ezh2過表達所回復。總之，研究結果揭示了RNA修飾和組蛋白修飾之間的串擾，并表明Mettl3介導的m6A修飾通過調節組蛋白甲基轉移酶Ezh2表達在調控成體神經形成和神經元發育中發揮重要作用。
實驗方法和流程設計
結果
（1）小鼠神經干細胞發育中mettl3的表達動態
（E-F）Western blot檢測m6A甲基化酶mettl3和mettl14在增殖和分化中的變化
（I）Dot blot和MS檢測增殖和分化過程中總體m6A修飾水平的變化
（2）m6A甲基化酶mettl3調控神經干細胞增殖
（A-B）mettl3沉默實驗：RT-PCR和WB驗證其表達沉默成功
（C-D）Dot blot和MS驗證mettl3沉默導致的m6A修飾水平下調（E-G）免疫熒光觀察：mettl3沉默影響了細胞增殖
（H）RT-PCR檢測mettl3沉默導致多種細胞周期蛋白mRNA水平下調
（I-K）流式細胞術分析沉默后細胞周期狀態發生改變
（3）m6A甲基化酶mettl3調控神經干細胞分化和發育
（F-G）Western blot：mettl3沉默和過表達對神經干細胞分化的影響
（H-L）Sholl分析檢測mettl3沉默和過表達對新生神經元細胞和海馬神經元的影響
（I-K）原位電穿孔圖像分析mettl3沉默對神經元的數量和長度的影響
（4）神經干細胞從增殖到分化的m6A修飾動態
（C）增殖和分化細胞的m6A修飾區域motif分析
（D）增殖和分化細胞中m6A修飾基因的重疊分析
（E-G）共有基因和獨有基因的GO功能富集分析
（H）m6A修飾基因和差異表達基因的重疊分析
（I）具有m6A修飾的差異表達基因的GO分析
（J）增殖和分化細胞中幾個差異m6A修飾基因的IGV展示
（5）mettl3通過m6A修飾調節基因表達，進而影響神經細胞增殖
（A）mettl3沉默樣本的m6Apeak分布、motif分析
（B）mettl3沉默前后的差異表達基因和m6A修飾基因的重疊分析（C）組學關聯分析火山圖（九象限圖的另一個版本）
（D-E）mettl3沉默后有m6A修飾的上調和下調差異表達基因的GO分析
（F）四個與神經發育功能相關基因在mettl3沉默后m6A修飾水平降低
（G）m6A修飾的差異表達基因功能網絡
（6）Ezh2受Mettl3調控，可挽救Mettl3基因下調引起的神經元發育和神經發生缺陷
（A-C）mettl3沉默導致Ezh2蛋白表達水平下調，CHIP實驗證明H3K27me3水平下調。
（D-E）mettl3沉默和Ezh2 m6A修飾區引入突變，都不影響Ezh2的mRNA水平
（F-I）免疫熒光觀察發現，mettl3沉默引起的神經細胞增殖和分化缺陷可被Ezh2過表達所回復
（D）Ezh2過表達挽救了受損的新生神經元的形態成熟
參考文獻：https://doi.org/10.1016/j.gpb.2018.12.007
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