解決方案|PBMC分離小妙招
PBMC（peripheral blood mononuclear cell），外周血單個(gè)核細(xì)胞，其主要細(xì)胞類型為血液里具有單個(gè)核的細(xì)胞，主要包括淋巴細(xì)胞（Ｔ＼Ｂ），單核細(xì)胞，吞噬細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞和其他少量細(xì)胞類型，其中淋巴細(xì)胞占很大一部分。分離ＰＢＭＣ的主要目的是為了將多核細(xì)胞和紅細(xì)胞去除，從而能夠很方便地模擬體外的血液免疫環(huán)境。從血液制備PBMC是分離特定免疫細(xì)胞亞群之前常見的一個(gè)步驟。最常用的PBMC分選方法是使用密度梯度離心液進(jìn)行離心。
工具/原料
全血 （以10ml為例）
無菌PBS溶液(pH7.4) 或者生理鹽水
蔗糖溶液（Ficoll Pague PLUS)
外周血淋巴細(xì)胞分離管
方法/步驟
1. 將分離液用移液管從分離管嵌套的中心孔中加入：15ml的分離管需要加入約4ml分離液；50ml的分離管需要加入約13ml分離液，確保分離液覆蓋嵌套上方。
2. 將抗凝樣本沿管壁緩慢倒入或用移液管沿管壁緩慢加入到分離管中。
3. 室溫下離心10min，離心力為1200 x g。
4. 收獲PBMC細(xì)胞，將分離管中上清倒入另一干凈離心管中，分離管中的嵌套能有效避免紅細(xì)胞和粒細(xì)胞再次污染。（注意：離心后傾倒收獲細(xì)胞前，也可先吸取采集或丟棄最上層血漿層，有助于減少細(xì)胞被血小板污染。）
5. 用PBS洗滌PBMC細(xì)胞，在250 x g離心力下離心10min。
6. 按步驟5重復(fù)洗滌2次，用5ml PBS緩沖液重懸細(xì)胞。
離心后液體分離情況（從上到下）：a血漿層；b富集的細(xì)胞部分（PBMCs）；c分離液；d嵌套；e沉淀（紅細(xì)胞和粒細(xì)胞）。
注意事項(xiàng)
1. 可用于人類外周血、骨髓和臍帶血樣本。不適用于血凝等異常樣本或超過48小時(shí)的樣本。
2. 15ml的分離管建議使用4-9ml樣本；50ml的分離管建議使用13-30ml樣本。
3. 對于放置24h以上的樣本，建議離心時(shí)間加長。
4. 離心后收獲細(xì)胞前，也可先吸取采集或丟棄最上層血漿層，有助于防止被血小板污染。
5. 離心后傾倒上清時(shí)不要將分離管倒置2s以上。
6. 分離管請勿重復(fù)使用。
7. 離心后，細(xì)胞可能聚集在富集層以上的分離管的管壁上。這種聚合是正常的，受樣本質(zhì)量、樣本放置時(shí)間和抗凝劑類型的影響。此聚合與分離管的使用無關(guān)。細(xì)胞可以通過使用移液管尖端輕刮聚集團(tuán)的一側(cè)來清除。
工具/原料
全血 （以10ml為例）
無菌PBS溶液(pH7.4) 或者生理鹽水
蔗糖溶液（Ficoll Pague PLUS)
外周血淋巴細(xì)胞分離管
方法/步驟
1. 將分離液用移液管從分離管嵌套的中心孔中加入：15ml的分離管需要加入約4ml分離液；50ml的分離管需要加入約13ml分離液，確保分離液覆蓋嵌套上方。
2. 將抗凝樣本沿管壁緩慢倒入或用移液管沿管壁緩慢加入到分離管中。
3. 室溫下離心10min，離心力為1200 x g。
4. 收獲PBMC細(xì)胞，將分離管中上清倒入另一干凈離心管中，分離管中的嵌套能有效避免紅細(xì)胞和粒細(xì)胞再次污染。（注意：離心后傾倒收獲細(xì)胞前，也可先吸取采集或丟棄最上層血漿層，有助于減少細(xì)胞被血小板污染。）
5. 用PBS洗滌PBMC細(xì)胞，在250 x g離心力下離心10min。
6. 按步驟5重復(fù)洗滌2次，用5ml PBS緩沖液重懸細(xì)胞。
離心后液體分離情況（從上到下）：a血漿層；b富集的細(xì)胞部分（PBMCs）；c分離液；d嵌套；e沉淀（紅細(xì)胞和粒細(xì)胞）。
注意事項(xiàng)
1. 可用于人類外周血、骨髓和臍帶血樣本。不適用于血凝等異常樣本或超過48小時(shí)的樣本。
2. 15ml的分離管建議使用4-9ml樣本；50ml的分離管建議使用13-30ml樣本。
3. 對于放置24h以上的樣本，建議離心時(shí)間加長。
4. 離心后收獲細(xì)胞前，也可先吸取采集或丟棄最上層血漿層，有助于防止被血小板污染。
5. 離心后傾倒上清時(shí)不要將分離管倒置2s以上。
6. 分離管請勿重復(fù)使用。
7. 離心后，細(xì)胞可能聚集在富集層以上的分離管的管壁上。這種聚合是正常的，受樣本質(zhì)量、樣本放置時(shí)間和抗凝劑類型的影響。此聚合與分離管的使用無關(guān)。細(xì)胞可以通過使用移液管尖端輕刮聚集團(tuán)的一側(cè)來清除。
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