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免疫共沉淀Co-IP實驗流程及文獻中的結果解讀

瀏覽次數:7443 發布日期:2023-1-4  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負

What is Co-IP?

Co-IP全稱Co-Immunoprecipitation,中文學名免疫共沉淀,是一種以抗體和抗原識別專一性為基礎,用于研究蛋白質之間相互作用的經典方法。
 

通俗點來說,假設我們需要研究樣品中A蛋白和B蛋白之間是否存在一些相互作用,首先我們通過合適的方法處理樣本,將蛋白提取出來(同時不能破壞蛋白之間的相互作用),然后用預先結合了瓊脂糖珠或者磁珠的A蛋白抗體捕獲樣本中的A蛋白,那么與A蛋白結合的B蛋白也能一起沉淀下來。再將蛋白從珠子上裂解下來,對B蛋白進行檢測,能檢測到,說明B蛋白在之前的沉淀過程中隨著A蛋白一起被拉下來了,進而證明二者之間存在相互關系。
 


How to do?

實驗流程

 A few tips:
※ 如何理解文獻中的結果?


各名稱解析:

IB:全稱immunoblotting,即免疫印跡,也就是常規的Western Blotting,用于顯示目的蛋白。

IP:全稱immunoprecipitation,即免疫沉淀,這一步主要是為了純化富集目的蛋白。

Input:全細胞裂解液,含有細胞內所有的蛋白,可認為是陽性組。也就是處理完樣本得到的細胞裂解液,在做IP實驗之前,需要先跑WB,確認樣本中含有蛋白A和蛋白B。

Anti-A:A蛋白的免疫共沉淀抗體

IgG:Anti-A的同型對照抗體,即跟Anti-A同來源同種型,如Anti-A是兔來源IgG型,則同型對照抗體需要選擇Rabbit IgG
 

結果圖解析

該結果是為驗證蛋白A與蛋白B是否存在相互作用。本實驗一共分為兩大組:Input組及IP組,其中IP組又分為IgG組(陰性對照組)和實驗組,并通過WB去驗證蛋白A和B在每一個組里面是否存在。由Input組的條帶可以得到結論:蛋白A與蛋白B都是存在的,證明樣本處理提取蛋白的步驟沒有任何問題。陰性對照IgG組和實驗組平行進行免疫沉淀實驗,結果蛋白A與蛋白B均沒有條帶,說明利用IgG抗體沒有把蛋白A和B沉淀下來,證明蛋白A和B與IgG沒有結合,排除了蛋白與抗體非特異性結合的可能性;而實驗組蛋白A和B均有條帶,表示利用蛋白A的抗體進行沉淀實驗,成功把蛋白A沉淀下來了,與此同時蛋白B也被沉淀下來,進而得到結論:蛋白A與蛋白B之間存在相互作用。
 

※  試劑盒寫著50T,意思是能做50次Co-IP實驗?

確切來說,試劑盒的50T代表著能夠完成50次免疫沉淀反應,而實際上免疫共沉淀實驗需要設置多個組別進行對照驗證,因此具體能夠完成多少次Co-IP實驗由設計方案決定,一般至少需要設置陰性對照、陽性對照、實驗組三個組別。
 

※  預清除步驟的作用是什么?必須要進行嗎?

這個步驟的目的是為去除樣本中可與protein A/G瓊脂糖珠非特異結合的蛋白質,減少干擾,非必做,如CoIP實驗中發現有較多雜帶,可考慮做一下;但應注意,選擇此步驟后,需要消耗瓊脂糖珠,后續能夠進行免疫沉淀的次數也相應減少。
 

※  陰性對照IgG組出現條帶是什么原因?
首先需要排除lgG和后續WB一抗同源導致的輕重鏈的干擾條帶(25kd和50kd附近);再者建議進行預清除實驗以排除Protein A/G的非特異性結合;再就是考慮lgG的問題可以換用其他品牌lgG嘗試。

 

※  出現假陽性結果該怎么排除?
假陽性結果需要設置對應的陰性對照組一一排除,假設實驗組為瓊脂糖珠+抗體X+靶蛋白X+抗體Y+目的蛋白Y:
 

可能出現假陽性結果的成因

對照組設置

瓊脂糖珠與X蛋白發生非特異結合

瓊脂糖珠+抗體X+抗體Y

瓊脂糖珠與Y蛋白發生非特異結合

瓊脂糖珠+蛋白Y

抗體X和目的蛋白Y非特異性結合

瓊脂糖珠+抗體X+蛋白Y

抗體的非特異性結合

IgG+蛋白X+蛋白Y


※  最后的實驗結果是陰性的,是否能說明兩個蛋白之間無相互作用?

對于內源性Co-IP實驗,陰性結果不能百分百說明無相互作用,也有可能是蛋白在細胞內表達過低導致,因此建議先做過表達Co-IP作為對照。

發布者:愛必信(上海)生物科技有限公司
聯系電話:021-38015121
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