核酸提取解決方案具體實(shí)驗(yàn)步驟

瀏覽次數(shù)：2557　發(fā)布日期：2022-12-7　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

核酸提取

核酸提取是指將核酸（DNA和RNA）從細(xì)胞中提取出來的過程，基本包括細(xì)胞裂解（Lysis）、雜質(zhì)與產(chǎn)物分離（Precipitation）、清洗產(chǎn)物（Wash）及產(chǎn)物重懸（Resuspension）的過程。

提取的效果與產(chǎn)物質(zhì)量控制可以通過后續(xù)核酸濃度、純度測定來實(shí)現(xiàn)。根據(jù)原始樣品的種類和核酸產(chǎn)物后續(xù)的各種應(yīng)用目的，細(xì)胞裂解和核酸純化步驟有不同的處理方法和要求。

實(shí)驗(yàn)室中的DNA提取

DNA提取過程最經(jīng)濟(jì)常用的方法為利用有機(jī)溶劑將裂解細(xì)胞后的蛋白雜質(zhì)變性沉降，使DNA溶于液相中，再離心分離，整個(gè)分離利用的是生物分子的可溶性差異。其他DNA提取方法還有無機(jī)法（鹽析法）、吸附法（微型柱）、磁珠法等。

案例：小鼠基因型判定實(shí)驗(yàn)的模板DNA提取

實(shí)驗(yàn)步驟：

1.將1cm尾巴切段置于1.5mL微量離心管中，加入適量裂解液（Lysis buffer）和蛋白酶（Proteinase K）于55~65℃水浴過夜消化。

2.充分消化后的尾巴樣品加入沉淀液（Precipitation buffer）后用旋渦混勻器來使雜質(zhì)蛋白充分沉淀，雜質(zhì)沉淀后通過離心操作（如4℃，4000Xg，5min），取出溶有目標(biāo)DNA的上清液，丟棄雜質(zhì)沉淀。

3.上清液中加入100%異丙醇，小心顛倒離心管30~40次，便可以將產(chǎn)物DNA沉降。離心操作（4℃，10000Xg或12000rpm，10min）去除上清。

4.用75%乙醇洗滌兩次DNA產(chǎn)物，待乙醇充分揮發(fā)后，用水或TE緩沖液（Tris-EDTA buffer）收獲DNA模板產(chǎn)物。

進(jìn)行后續(xù)的PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)前，可以使用Nanodrop儀器進(jìn)行DNA濃度和純度的測定，提高PCR反應(yīng)的成功率。在PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)不順利的情況下，也可以進(jìn)一步對DNA產(chǎn)品的完整度進(jìn)行檢測。

室中的RNA提取實(shí)驗(yàn)

RNA提取過程與DNA類似，也是通過裂解細(xì)胞后通過有機(jī)溶劑沉降雜質(zhì)的方法來分離RNA。但RNA的穩(wěn)定性比DNA低很多，因此RNA提取對溫度和污染清除的要求更高。實(shí)驗(yàn)操作一般從以下幾個(gè)角度來提升成功率：降低RNA水解酶活性、提升RNA穩(wěn)定性、使RNA與DNA和蛋白分離、僅沉降RNA、有效去除DNA。

案例：總RNA提取

實(shí)驗(yàn)步驟與DNA提取類似，但有機(jī)溶劑的使用會(huì)有所不同。在首次離心后，混合物會(huì)分為三層，RNA溶于上層無色水相，而DNA和蛋白會(huì)處于中間層，組織殘?jiān)入s質(zhì)處于底層。實(shí)驗(yàn)步驟：1.向提取樣品中加入裂解液（如Trizol），裂解細(xì)胞與組織，室溫靜置5-8分鐘。2.充分混勻后離心（4℃，12000rpm，10min），取出上清液。3.向上清液中加入異丙醇沉降RNA，并離心（4℃，12000rpm，10min）棄去上清。4.用75%乙醇洗滌產(chǎn)物兩次，待乙醇揮發(fā)后加入RNase-free水溶解產(chǎn)物。

實(shí)驗(yàn)中用到的耐思耗材和儀器