花青（cyanine）是一類具有靈活特性的熒光染料，將cyanine與其他功能分子進行偶聯（共價綴合）代表了一類獨特的設計策略，在基礎和臨床成像研究中具有巨大的應用潛力�；�于此，北京大學工學院生物醫學工程系戴志飛教授團隊，對最近7年發表的文獻中關于運用cyanine偶聯策略進行生物醫學影像探針研發所取得的進展進行了總結。我們在此選擇一些比較有代表性的概念及成果與大家進行分享：

基于cyanine的熒光探針優勢

幾種商品化的花青染料（cyanine dyes），如噻唑橙（Thiazole Orange，TO）、Cy5.5、吲哚菁綠（Indocyanine Green，ICG）、IRDye800-CW、ZW800-1，已被成功開發出來（見圖1），廣泛用于科學研究。

圖1：常用cyanine dyes化學結構，紅色標記原子表示用于綴合的反應基團。

目前，已有大量圍繞cyanine dyes作為熒光骨架而展開的結構修飾與功能化研究，以提高其整體的熒光性能并擴展其成像范圍，其中，將cyanine dyes與其他功能性分子進行偶聯（共價綴合），是一種直接而有效的方法。

在各種不同光譜特性的cyanine dyes中，Cy5和Cy7是進行共價綴合的優先選擇，特別是對于活體成像的應用，其具有在NIR“生物窗”波段（＞650nm）進行成像的多種優勢：深層的組織穿透性，較低的光毒性，可有效減少光散射，具有高信噪比（可最大限度地避免由生物樣本產生的自發熒光的干擾）。

用于靶向熒光成像的探針

將分析物敏感部位（analyte-sensitive moieties）結合到cyanine dyes支架中、以此獲得cyanine化學傳感器，是檢測小分子物質的首選工具，包括活性物質（活性氧、氮）、生物硫醇（Cys、Hcy、GSH）、無機親核試劑（N2H4、H2S、CN-）和重金屬離子等。這種探針檢測模式的主要機制是由分析物引發的反應。
另一方面，許多生物大分子與多種疾病的發生、發展和預后過程密切相關，因此，對于這些目標部位的特異性檢測不僅可以促進基礎研究，還具有臨床應用價值。cyanine與靶向彈頭的結合為這些生物大分子的靶向熒光成像提供了強大的可視化工具，其中蛋白質構成了最大的一群目標類型。靶向彈頭的分類見圖2：

圖2：可與cyanine熒光基團結合、用于蛋白質和核酸靶向熒光成像的靶向彈頭類型。
蛋白質具有相似的靶向策略，其靶向彈頭的范圍從傳統的抗體、小分子和肽到新興的核酸適配體、非免疫球蛋白支架。而在核酸方面，相應的靶向彈頭主要包括寡核苷酸及其合成類似物（PNA、肽核酸）等。在此僅對抗體偶聯探針的情況做詳細介紹：

cyanine-抗體偶聯探針

抗體具有針對抗原的特異性和敏感性，是一種代表性的靶向彈頭。由于抗原涵蓋的生物分子范圍廣泛，包括蛋白質、肽和多糖，因此cyanine-抗體偶聯物的適用性非常出色。除全長單克隆抗體 (mAb)外，抗體片段以及雙抗、三抗、微型抗體和納米抗體等也可被用作靶向彈頭。其中，較小的抗體片段具有更深的腫瘤/組織穿透性和更快的血液清除率等優點，可以在注射后早期進行高對比度成像，并且其免疫原性也更低。
當前，癌癥靶向成像是最具應用前景的領域，研究人員廣泛研究了可促進cyanine偶聯物在腫瘤中積累的抗原，其中大多數是在癌細胞上過度表達的膜結合抗原：有些是具有癌癥特異性的，如結直腸癌和胰腺癌中的癌胚抗原（CEA），乳腺癌和卵巢癌中的人表皮生長因子受體2(HER2)；而其他則是泛腫瘤生物標志物，如表皮生長因子受體 (EGFR)。此外，存在于腫瘤微環境中的抗原也提供了可替代靶點，如血管內皮生長因子(VEGF)�？傮w而言，cyanine-抗體偶聯物可作為基于抗體-抗原相互作用原理的多功能診斷和研究工具。
例如：免疫球蛋白上有大量的活性賴氨酸殘基，利用簡便的孵育程序，便可促成cyanine NHS-ester與賴氨酸殘基之間的偶聯反應（圖3a）。

圖3：a）通過賴氨酸殘基方式進行連接的cyanine-抗體偶聯物(1-4)。
偶聯物1和2分別通過將Cy7 NHS ester與靶向CD20的完全人源化的mAb或與靶向卵巢癌相關抗原OC183B2的小鼠mAb直接偶聯而合成；活體近紅外熒光成像（NIRF）實驗結果表明，它們主要在小鼠異種移植模型的腫瘤和肝臟中積累。
采用類似方法，可將A11微型抗體（一種針對PSCA的人源化抗體片段）與IRDye800CW NHS ester進行偶聯，由此產生的偶聯物3可成功檢測到hPSCA轉基因小鼠體內的原發性原位腫瘤和轉移性淋巴結。

此外，還可將賴氨酸殘基的氨基轉化為另一個反應基團用于點擊化學（click chemistry），例如，根據中國醫學科學院醫學實驗動物研究所史旭東博士及其同事的報道：利用四嗪NHS ester可得到四嗪修飾的貝伐單抗，通過靜脈注射使其靶向VEGF并得以在體內與隨后施用的Reppe酸酐標記的Cy5進行生物正交綴合。采用該種策略，研究人員可利用偶聯物4、并借助熒光發射計算機斷層掃描（FLECT/CT）成像技術，成功地對表達VEGF的結腸癌細胞異種移植物進行可視化觀察（圖3b）：

圖3：b）靜脈注射4小時后，在小鼠異種移植模型中捕獲的Reppe酸酐-Cy5的FLECT/CT圖像，其中，預靶向組使用貝伐單抗-四嗪（偶聯物4）預處理24小時，對照組不做預處理。白色箭頭示腫瘤區域。

• 多模態成像探針

光學成像，放射成像，X射線計算機斷層掃描（CT），磁共振成像（MRI），超聲成像以及核醫學成像（NM，如正電子發射斷層掃描（PET）、單光子發射計算機斷層掃描（SPECT））是臨床實踐中常用的成像模式。多模態成像，如其名稱所示，是將互補的成像模式進行集成，以便通過單次成像最大化地獲取信息，并彌補各單一成像模式所存在的局限。
NIRF成像模式可避免有害的電離輻射，并有利于獲取高靈敏度的實時圖像。與CT、MRI、PET、SPECT等其他方式相比，單一的NIRF具有空間分辨率低的局限，因此可以通過共價綴合的偶聯方式獲取多模態成像造影劑，或針對靶向分子制備多模態成像探針，以解決應用上的挑戰。

以cyanine為基礎的NIRF可與MRI、NM整合為MRI/NIRF、NM/NIRF類型的多模態成像模式，NM/NIRF還可進一步分為PET/NIRF和SPECT/NIRF，如圖4所示：

圖4：與cyanine偶聯的多模態成像探針舉例：MRI/NIRF，PET/NIRF和SPECT/NIRF。
技術聚焦：
基于Cyanine偶聯策略可進行生物醫學影像探針的研發，包括靶向彈頭和其他可用于靶向熒光成像的造影劑以及多模態成像探針。在此過程中，一些新穎的技術手段的運用可以幫助研究人員快速獲取更加直觀有效的圖像和結果，如FLECT/CT技術（提供深部組織的3D熒光信號細節，利于目標部位的精準定位）。我們期待看到cyanine偶聯物探針作為生物醫學影像診斷工具的應用潛力得到進一步開發，并促進臨床轉化方面的進展。

期刊名稱：Advanced Healthcare Materials
原文標題：Cyanine Conjugate-Based Biomedical Imaging Probes

作者：Yang Li, Yiming Zhou, Xiuli Yue, Zhifei Dai
發表時間：2020
DOI：10.1002/adhm.202001327

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