通常Western Blot每孔上樣量為30-50μg，80%蛋白在細胞中的含量很低，當蛋白分子量過小時，上樣量建議選擇50-100μg。畢竟對 于小分子的蛋白來說，在跑電泳時，稍不留心，蛋白就跑沒影了。

 

1.選擇合適膠濃度。分子量小的蛋白，建議配置5%的濃縮膠，分離膠濃度參考下表。

分子量（kDa)	分離膠濃度
X≤10	15%
10	13.5%
15	12%

2.電泳電壓太大會導致跑在最前面的小分子蛋白成鋸齒狀，建議濃縮膠用80V 30分鐘，之后調成100V, 溴酚藍跑到距膠底1cm以上就停下，不要跑到底，否則目的蛋白可能跑出去了。

 

1.膜的選擇。免疫印跡中常用的固相材料有 NC 膜、DBM、DDT、尼龍膜、PVDF 膜等。推薦選用 PVDF 膜（聚偏二氟乙烯），因為蛋白質與 PVDF 膜以疏水力結合，從而將親水部位暴露到液相，使抗體更容易與之結合。

 

針對不同分子量的蛋白質，PVDF 膜有兩種規格：0.45 μm 的膜適合檢測 MW ＞ 20 kDa 的蛋白質，0.2 μm 的膜適合檢測MW ＜ 20 kDa 的蛋白質，而且0.2 μm 的膜可以有效防止蛋白質在轉移過程中直接穿透過膜。PVDF 膜使用之前需要在甲醇中浸泡 5min 后再轉入轉移液中，PVDF膜用甲醇泡的目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團，使它更容易跟帶負電的蛋白質結合。

 

2.轉膜方式。對于小分子蛋白，電流太大或時間太長容易轉過。轉膜采用濕轉，條件參考下圖

 

PVDF膜經麗春紅染色后，可以檢測出樣品電泳過程中呈現印跡的大小，通過各個泳道上樣品印跡的對比，可以初步判斷上樣量的準確性。

 

通常抗體的說明書上都會給出一定的稀釋比例對于分子量過小的蛋白來說，一抗應選擇低的稀釋比例，這樣有助于抗體的結合。