草甘膦（GLY）是一種高效、低毒、廉價(jià)的內(nèi)吸傳導(dǎo)型廣譜滅生性除草劑，被廣泛施用于茶園等農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。隨著草甘膦的廣泛使用，其在茶葉、水果等植物源食品中殘留量的檢測越來越受到關(guān)注。草甘膦及其代謝物氨甲基膦酸具有極性強(qiáng)、易溶于、難溶于各種有溶劑，這給常規(guī)檢測帶來了極大的困難和挑戰(zhàn)。

 

逗點(diǎn)生物在2021年推出過檢測茶葉中Copure®草甘膦的專用柱（貨號(hào)：COGLY3000）及其應(yīng)用方案。

 

然而，客戶在方法開發(fā)時(shí)依然遇到了很多問題，如方法很難重現(xiàn)、峰形不好、質(zhì)譜找不到母離子等，鑒于此我司對該法進(jìn)行了完善，詳細(xì)考察了其前處理?xiàng)l件，并用優(yōu)化后的方法對紅茶、綠茶、青茶進(jìn)行了樣品處理，都能夠獲得滿意的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本文把完善后的方案及優(yōu)化過程一并呈現(xiàn)給大家，供參考。
 

一、樣品提取

準(zhǔn)確稱取經(jīng)粉碎的茶葉1.0 g于50 mL離心管中，加入濃度為 10 μg/mL草甘膦內(nèi)標(biāo)100 μL，再加入10 mL 水，渦旋混勻15 min，超聲提取15 min，以10000 r/min離心5 min，待凈化。

 

二、樣品凈化

移取5 mL上清液至50 mL 離心管中，加入5 mL二氯甲烷，渦旋混勻5 min，以10000 r/min離心5 min，取2.5 mL上清液過固相萃取柱（使用前用3 mL甲醇和3 mL水活化），棄掉前端幾滴液體，再收集后續(xù)流出液，待衍生。
 

▲Copure®草甘膦專用柱▲

 

三、衍生

取1.0 mL 上述的凈化液，加入0.2 mL 50 g/L 硼酸鈉緩沖溶液，渦旋混勻，再加入0.2 mL 10 g/L FMOC-Cl 丙酮衍生液，渦旋混勻后置于45 ℃下衍生2 h，以10000 r/min離心5 min，過0.22 μm濾膜，上機(jī)測試。

 

四、標(biāo)曲配制

吸取一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和同位素內(nèi)標(biāo)溶液，用水稀釋定容至1.0 mL，使每毫升混合標(biāo)準(zhǔn)工作液含有同位素內(nèi)標(biāo)100 ng/mL。加入 50 g/L 硼酸鈉緩沖溶液0.2 mL，混勻，再加入10 g/L FMOC-Cl溶液0.2 mL，渦旋混勻后同樣品置于45 ℃下衍生2 h，配制成上機(jī)濃度分別為5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL。

 

五、儀器條件

【液相部分】

色譜柱：Commail® BEH T-C18

(2.1 mm×100 mm,3 μm)

流動(dòng)相：A：5 mmol/L乙酸銨溶液  B：乙腈

流速：0.4 mL/min   

柱溫：30℃   

進(jìn)樣量：5 μL

洗脫程序：梯度洗脫表1

表1 梯度洗脫程序

 

【質(zhì)譜條件】

離子源：HESI      

電噴霧電壓：3500 V     

鞘氣壓力：40 arb  

輔氣壓力：10 arb    

離子傳輸管：260 ℃     

輔氣溫度：350 ℃

表2 組分名稱、保留時(shí)間

及特征離子一覽表（*為定量離子）

 

六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

【測試數(shù)據(jù)】

表3 加標(biāo)回收率結(jié)果

【測試色譜圖】

圖1 添加水平為0.50 mg/kg的鐵觀音總離子流圖

 

七、實(shí)驗(yàn)過程分析

【衍生劑濃度】

如圖2所示，考察衍生劑濃度分別為1g/L、5g/L、6g/L、8g/L、10g/L和20g/L，添加量為0.2 mL時(shí)標(biāo)液中目標(biāo)物的峰面積變化，從圖中可以看出衍生劑加入量≥6g/L時(shí)，目標(biāo)物峰面積無明顯變化。考慮到樣本中的基質(zhì)會(huì)消耗一定量的衍生劑，建議適當(dāng)增大衍生劑的濃度，方案中衍生劑的濃度為10 g/L。

圖2衍生劑濃度對目標(biāo)物的影響
 

【衍生時(shí)間】

考察不同衍生時(shí)間，0.5~4小時(shí)（衍生溫度40℃）及12小時(shí)（室溫過夜20 ℃）。結(jié)果如圖3所示，草甘膦和氨甲基磷酸在衍生時(shí)間≥2小時(shí)，目標(biāo)物峰面積無明顯變化，室溫過夜有利于衍生完成。綜合考慮時(shí)效性，方案中衍生時(shí)長為2小時(shí)。
 

圖3 衍生時(shí)間對目標(biāo)物的影響
 

【衍生溫度】

考察不同溫度對衍生的影響，衍生溫度大于35 ℃時(shí)，草甘膦和氨甲基膦酸以及內(nèi)標(biāo)的峰面積無太大差異，方案中選擇45℃為衍生溫度。