熒光納米探針在生命科學成像中的應用
納米材料“點亮”生命科學
—熒光納米探針的生物成像應用
本文作者：Dr. Jessy
從羅伯特虎克自制鏡筒下的小隔間般的植物細胞，到下村修實驗室中翠色熒熒的水母蛋白，再到莊小威顯示屏上晦明倏爍的染料分子對，我們從未停下用光學成像探索生命微觀世界的腳步。而同樣作為二十一世紀產業革命的中流砥柱的納米技術，在材料科學的賽道上蓬勃發展至今，終于與生命科學碰撞產生了新的火花—熒光納米探針，用納米材料的光，點亮生命微觀世界。
1、引 言
熒光（fluorescent），是一種光致發光的自然發光現象。
自然中的熒光現象不勝枚舉，而從發光水母中提取的綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein, GFP），是自然給予我們探索微觀生命世界的第一個火種。將綠色熒光蛋白的基因導入其他生命體內表達，就可以使原本不具備自然熒光性質的生物也能產生綠色熒光。科學家通過解析GFP的結構及發光原理等研究，進一步提升了其顏色種類、光強、穩定性等性質，極大地推動了熒光蛋白在生物成像中的應用。
雖然熒光蛋白家族日益壯大，但是在應用范圍上仍然有所局限，此外，熒光蛋白的發射光譜較寬且不規則，多色同步成像時易發生串色。通過與化學合成的碰撞，有機熒光染料順勢而生，其品類豐富、操作簡單，不但極大地擴展了熒光成像的應用范圍，還方便進行標準商業化生產，為熒光成像的大發展奠定了扎實的基礎。
圖1. (a)量子點結構示意圖及CdSe/ZnS量子點吸收、發射光譜圖[1]。
(b)上轉換納米探針示意圖[2]及980nm激發下不同摻雜比例的NaLuF4溶液發光圖像[3]。
但有機染料仍然不是熒光成像的最佳拍檔，其熒光效率低、光穩定性差等缺點，都是阻礙熒光成像發展的絆腳石。
在此同時，納米技術也在材料領域如火如荼地掀起新一輪技術革命，納米材料自身特殊的光學特性、可定向合成組裝等優點，均為熒光成像注入了全新的血液。
目前常見熒光納米材料有半導體量子點(Quantum dots, QDs)、上轉換稀土材料(Upconversion nanoparticles, UCNPs)、金屬納米粒子等。與其他染料相比，熒光納米材料具有量子產率高、穩定性強、斯托克斯位移大、激發光譜寬而發射光譜窄等優點，且可以通過尺寸調節發射波長，通過組裝修飾提高其生物相容性、豐富識別傳感等功能，是未來熒光標記的最佳選擇之一。
2、熒光納米探針基本工作流程
作為納米化學與生物成像的交叉結合位點，熒光納米探針的工程流程與傳統的生物成像的有所不同，是個涵蓋理論計算、化學合成、生物成像，甚至醫學檢測等多學科多領域的長鏈過程。
圖2. 熒光納米探針基本工作流程
首先，熒光納米探針的研究過程大多為應用導向的，根據具體的生物應用需求設計具有特殊光學性質或其他功能的納米材料（如近紅外、上轉換、雙光子等），然后進行納米材料的合成與表征，篩選出高質量的納米材料。
隨后，再進一步考慮探針的生物相容性或光控、載藥、識別等功能性的需求，對探針進行修飾組裝。最后，在熒光納米探針的生物成像階段，往往會從體外細胞到體內組織/細胞，最終應用于活體動態成像，或進一步服務于醫療診斷研究。
光學顯微鏡在熒光納米探針的研究中的應用，大多集中在納米材料的表征篩選和探針的生物成像應用兩個部分。在材料的表征篩選階段，由于納米材料具有內在的結構異質性，個體性質往往具有很大的個體差異性。與傳統的檢測大量粒子整體性質的方法相比，光學顯微鏡可在單粒子水平篩選出高質量探針，并進一步研究其構效關系，指導納米材料的設計以改善其性能。而在生物成像階段，光學顯微鏡則可以可在單粒子水平檢測納米探針的光學信號，實現對其時空動態變化過程的成像追蹤。
3. 熒光納米探針典型應用及顯微鏡解決方案
3.1 近紅外/上轉換探針 -FV3000近紅外成像解決方案近紅外成像由于具有穿透深、光毒性小、組織自發光干擾小等優點，成為現今光學成像的研究熱點。
而熒光納米探針如量子點，可以通過調節化學組成及形貌尺寸，輕松實現近紅外激發。此外，上轉換納米材料具有受長波長(近紅外)的光激發時，可發射比激發光波長更短的光(可見光或者紫外光)的特殊光學性質，被認為是新一代熒光生物標記材料之一，有望在生物醫藥、能源催化等領域發揮重要的作用。
在體肝毒性的靈敏實時檢測是目前藥物性肝損傷診斷的難點。中國藥科大學天然藥物國家重點實驗室的李會軍教授課題組2020年在Nanoscale發表的A sensitive upconverting nanoprobe based on signal amplification technology for real-time in situ monitoring of drug-induced liver injury研究論文中，設計了一種由上轉換納米粒子(upconversion nanoparticles, UCNPs)和金納米棒(gold nanorods, GNR)組裝的上轉換納米探針，并將其用應用于藥物肝損傷的原位實時診斷。
這種新型的納米探針可在肝臟內聚集并被肝臟損傷標志物——miR122特異性激活，在980nm近紅外光激發下產生800nm的熒光成像，結合發光共振能量轉移（luminescence resonance energy transfer, LRET）效應和信號放大技術，進一步提高其檢測靈敏度，可實現對miR122的高靈敏檢測，為藥物肝損傷的臨床實時監測提供了新的思路[4]。
使用Olympus FV3000拍攝的 miR122過表達(OE)及敲除(KD)的HL7702 細胞的上轉換發光圖像[4]。
與常規共聚焦成像相比，近紅外/上轉換納米探針成像需滿足以下技術要求：
1、常規共聚焦顯微鏡的激發波長大多在400-650nm之間，而近紅外成像需要>700nm波長的近紅外激光器。2、常規成像光路部件如掃描振鏡、物鏡、光柵等大都只在可見光范圍進行增透/校準，無法保證近紅外成像效率及準確度
3、近紅外檢測需要>750nm近紅外專用檢測器。
面對以上需求，Olympus FV3000激光共聚焦顯微鏡提供了成熟系統的近紅外成像解決方案，致力于高靈敏、更準確多色的近紅外成像。
此外，FV3000還可拓展ANALOG單元，將外部電壓信號記錄為圖像數據與掃描圖像同步。還可將掃描時間信號傳送到外部設備，通過BNC端口輕松實現與第三方外部設備的聯用，輕松實現熒光信號與電化學信號、FLIM等多模態檢測信號的同步。
3.2 腫瘤標記物在體成像 -FVMPE-RS活體深層檢測方案
癌癥已成為世界最嚴重的公共健康問題之一，對惡性腫瘤的早期診斷及準確切除也已成為目前醫學研究的重中之重。
而通過設計開發新型熒光納米探針，實現對腫瘤標記物的特異性識別、高分辨在體成像，可以為惡性腫瘤的早期臨床診斷以及外科準確切除提供新的檢測方案。腫瘤細胞中的酶如堿性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）的過度表達是腫瘤發生、發展和惡化的重要臨床指標，因此對堿性磷酸酶活性的靈敏快速檢測有助于腫瘤的早期發現和準確切除。
大連理工大學精細化工國家重點實驗 彭孝軍 院士 團隊2020年在Angew. Chem. Int. Ed.（德國應用化學）發表的An Activatable AIEgen Probe for High-Fidelity Monitoring of Overexpressed Tumor Enzyme Activity and Its Application to Surgical Tumor Excision的研究成果中，設計制備了一種用于堿性磷酸酶（ALP）活性成像的AIEgen探針（DQM-ALP）。
這種探針具有聚集誘導發光性質，與腫瘤細胞過表達的堿性磷酸酶作用后會聚集產生強熒光，克服了常規有機染料容易聚集熒光淬滅的缺點，在進一步提高檢測靈敏度的同時也提高了探針在腫瘤細胞的滯留時間。
該工作首次監測到了丁酸鈉和皮質醇刺激對腫瘤細胞堿性磷酸酶活性的上調作用，并通過雙光子顯微鏡實現了對HeLa和HepG-2腫瘤球體中堿性磷酸酶活性的高空間分辨率三維深層成像，證明了該探針可應用于亞毫米級腫瘤的熒光檢測成像，為腫瘤的臨床診斷和手術切除提供了有力的輔助工具[5]。
圖4. DQM-ALP AIEgen探針組裝應用示意圖。
DQM-ALP探針標記Hela多細胞腫瘤球體單/雙光子熒光圖像。
以上研究中使用了Olympus多款單/雙光子共聚焦顯微鏡，而最新 FVMPE-RS雙光子顯微鏡，專為活體深層熒光成像設計，獨家的高速掃描振鏡和高靈敏檢測光路，可在更準確高效地實現對腫瘤標記物的高分辨率三維深層成像。
而雙譜線/雙激光以及最多四通道高靈敏檢測器的專業配置，可以更靈活地進行多色同步成像，進一步提高檢測的通量及效率。此外，獨立于成像的同步光刺激模塊，可在時間和空間上完美實現飛秒激光對樣品的精確空間光刺激及信號的同步快速采集，是光控、光動力等特殊納米探針檢測的不二之選。
3.3 活細胞探針動態檢測 –SpinSR快速超分辨解決方案
活細胞中的生物化學反應等分子事件往往具有顯著的時空動態特性，通過光學成像技術可精確追蹤納米探針的運動軌跡，研究其與生物分子的相互作用，可有效監測其動態變化，并進一步探究其狀態與相關細胞功能的關系。內體、溶酶體等細胞器在信號轉導、維持代謝平衡等方面發揮著關鍵作用，由于這些細胞器在內吞過程中pH會發生變化，因此對這些細胞器pH值的快速靈敏檢測成為動態監測內吞過程、探究其狀態與功能關系等研究的重點。
北京大學汪貽廣教授、德克薩斯大學西南醫學中心Gao Jinming教授團隊2016年在Advanced Materies發表的Digitization of Endocytic pH by Hybrid Ultra-pH-Sensitive Nanoprobes at Single-Organelle Resolution論文中，設計了一種單細胞器分辨率的pH超靈敏納米探針 (HyUPS)，用于追蹤檢測內吞過程中內體/溶酶體等細胞器的pH變化。
該探針含有三種pH敏感的組分，對應內吞過程的三種組分及三個pH范圍，并分別使用紅綠藍三種熒光團標記。該探針成功實現了活細胞內吞相關細胞器酸化速率的動態多色實時監測，為研究內體/溶酶體功能障礙疾病的進一步研究提供了新的成像工具[6]。
圖5. HyUPS納米探針檢測受體介導的腫瘤細胞內吞過程中細胞器pH變化示意圖。
使用轉盤共聚焦顯微鏡對Hela細胞中單個HyUPS納米探針標記的內吞細胞器實時動態追蹤熒光圖像[6]。
對活細胞探針的成像需要借助高速成像設備，而傳統的點掃描共聚焦難以滿足這類實驗要求。Olympus SpinSR轉盤共聚焦超高分辨成像系統，輕松實現多色超高分辨（110nm）快速（200fps）成像，適合捕捉精細結構的快速動態過程，堪稱生命科學研究者輕松提高成像效率的利器。獨有的RTCe（Real Time Controller）控制各部件同步工作，最大限度降低激發光對樣品的影響，配合專為深層活組織成像設計的硅油物鏡，更適合對活細胞、細胞球及類器官等樣品進行長時間深層準確成像。
近十幾年來, 隨著納米技術和光學成像技術的飛速發展, 基于熒光納米探針的生物化學成像應用已取得了許多重要進展。但是，熒光納米探針在應用上仍然受制于其生物相容性、存在熒光閃爍行為等不足。隨著納米材料、生物成像以及化學合成、理論物理、圖像分析等學科的不斷發展、交流、融合，可望進一步提高熒光納米探針生物成像的特異性、準確性、穩定性和重現性, 使之在更多領域發揮更重要的作用。
參考文獻：
[1]. Liu S., Wang Z, Xie H, Liu A, Pang D. Single-Virus Tracking: From Imaging Methodologies to Virological Applications[J]. Chemical Reviews, 2020, 120(3).
[2]. Chang H, Xie J, Zhao B, Liu B, Xu S, Ren N, Xie X, Huang L, Huang W. Rare Earth Ion-Doped Upconversion Nanocrystals: Synthesis and Surface Modification[J]. Nanomaterials, 2014, 5(1):1-25.
[3]. Chen Z, Wu X, Hu S, Hu P, Liu Y. Multicolor upconversion NaLuF4 fluorescent nanoprobe for plant cell imaging and detection of sodium fluorescein[J]. J. Mater. Chem. C, 2015, 3, 153-161
[4]. Meng L, Zheng X, Zheng Z, Zhao Z, Wang L, Zhou P, Xin G, Li P, Li H. A sensitive upconverting nanoprobe based on signal amplification technology for real-time in situ monitoring of drug-induced liver injury. Nanoscale. 2020 Jul 23;12(28):15325-15335.
[5]. Li H, Yao Q, Xu F, Li Y, Kim D, Chung J, Baek G, Wu X, Hillman P, Lee E, Ge H, Fan J, Wang J, Nam S, Peng X, Yoon J, An Activatable AIEgen Probe for High-Fidelity Monitoring of Overexpressed Tumor Enzyme Activity and Its Application to Surgical Tumor Excision. Angew. Chem. Int. Ed. 2020, 59, 10186.
[6]. Wang, Y., Wang, C., Li, Y., Huang, G., Zhao, T., Ma, X., Wang, Z., Sumer, B. D., White, M. A., Gao, J., Digitization of Endocytic pH by Hybrid Ultra‐pH‐Sensitive Nanoprobes at Single‐Organelle Resolution. Adv. Mater. 2017, 29, 1603794.
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