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UHPLC-MS在下游生產工藝中HCP定性/定量分析的應用

瀏覽次數:2469 發布日期:2021-8-9  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負
UHPLC-MS方案|下游生產工藝中HCP定性/定量分析
 

 
前言
 
宿主細胞蛋白 (Host Cell Protein, HCP) 是細胞生長和后續生產工藝中來源于宿主細胞系的生物藥品雜質,會對藥品最終的安全性和有效性產生不利影響。因此,必須通過一系列純化步驟去除這些 HCP。國際人用藥品注冊技術協調會(ICH)、美國食品和藥物管理局 (U.S. FDA)、歐洲藥品管理局 (EMA) 和其他國家的監管機構都有關于 HCP 監測的指南。
 
在本文的研究中,我們對三個來自于下游生產工藝不同純化階段的樣品進行了基于LC-MS高分辨質譜串聯平臺的定性及定量分析,并對每個樣品中存在的高風險HCP進行了特別標注。分析流程請見圖1。
 
圖1 實驗整體流程
 
在經過一步ProteinA純化后的樣品中,鑒定到676個具有定量信息的HCP(peptide≥3,下同);再經過一步陰離子交換色譜(AEX)純化后,HCP數目下降至111;在此基礎上再進行一步陽離子交換色譜(CEX)純化后,僅檢測到7個HCP。三個樣品中定性及定量的HCP數目請見表1。
 
表1 不同純化階段樣品中定性并定量的HCP,所有數據均為三次生物重復的平均值
 
對于會引起免疫響應、降解蛋白或輔料的高風險HCP是科學家們在產品工藝的優化過程中尤為注意的。圖2展示了隨著純化步驟的增多,高風險HCP數目呈減少趨勢。圖3展示了經過三步純化后依然能夠鑒定到的三個高風險HCP及其各自的含量。
 
圖2. 不同樣品中高風險HCP數目變化趨勢
 
圖3. 經過三步純化后樣品中依然能鑒定到的高風險HCP(點擊查看大圖)
 
本實驗中所有數據均是由一站式生物制藥分析軟件BioPharma Finder4.1處理。該軟件內置HCP分析功能,可同時對目標蛋白和HCP進行搜庫、定性和定量(圖4~6)。
 
圖4 HCP鑒定結果展示界面
 
圖5 同一個HCP在不同樣品中的變化趨勢,每個樣品均進行了三針技術重復
 
圖6 三步純化后一條來源于高風險HCP肽段的二級譜圖及覆蓋率
 
客戶得益
 
用非變性酶解條件進行 HCP 鑒定和相對定量的工作流程,然后進行 LC-MS/MS 分析。
使用 UHPLC 系統和高分辨率精確質量 (HRAM) 質譜儀在寬動態范圍內進行HCP定性與相對定量,靈敏度可低至約 1ppm。
為各個 HCP 提供定性和定量信息,可用于指導下游工藝開發和優化決策。
證明 POROS 樹脂具有高選擇性,可有效去除不同含量和種類的 HCP。
Biopharma Finder 4.1單一軟件解決方案,可同時提供目標蛋白的肽圖分析結果及HCP的定性定量結果。
 
本研究中使用的樣品由賽默飛生物工藝部下屬的生物工藝設計中心(Bioprocess Design Center, BDC)所提供。該中心總監馬駿表示,近年來,有關抗體藥品中的HCP可能導致臨床不良反應的報道屢見不鮮,其中某些高風險HCP被發現可能是導致不良反應的主要因素。這些案例從客觀上對我們提出了一個新要求:在抗體藥物的CMC開發過程中,越早對HCP進行更進一步的分析鑒別,越快在工藝開發中去除高風險HCP,就越有利于該藥品在臨床階段的成功,而LC-MS聯用的方法無疑為這一需求提供了可靠的工具。
 
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發布者:賽默飛世爾科技(色譜與質譜)
聯系電話:13386161207
E-mail:ping.shen2@thermofisher.com

標簽: UHPLC-MS
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