利用主動式染色SmartLabel實現3D全器官染色
100多年前德國解剖學家Werner Spalteholz發(fā)表了關于生物醫(yī)學樣品進行組織透明化處理的最早報告，首次成功地觀察到透明樣品的宏觀結構[1]。隨著最先進的組織透明化方法和3D成像技術的出現方法，科研人員已經能夠以細胞到亞細胞的分辨率全面觀察單個器官或組織甚至單個生物體。而收集細胞的相關生物信息需要根據組織結構、細胞類型和細胞活性進行適當的標記[2]。
經典的免疫熒光和熒光原位雜交分別標記蛋白質和mRNAs的方法，最常用于薄組織切片中，熒光結合的大分子在其中可以快速擴散。通常小組織可以很容易地用分子探針（如抗體）染色；然而，就像所有依賴被動擴散的組織處理方法一樣，大組織的染色需要更長的孵育時間，因此即使在脫脂或水凝膠包埋后，探針也需要數周或數月才能徹底穿透大樣本[3]。
此外，在傳統的被動標記方法中，用于標記的實驗參數（例如孵育時間、探針量）高度依賴于樣品性質（例如組織類型、大小、形狀）和靶蛋白性質（例如表達水平、分布模式），因此，每個實驗都需要費力、昂貴和耗時的優(yōu)化。被動標記的結果在許多情況下是高度不均勻的，外部區(qū)域標記飽和，核心區(qū)域標記較弱甚至沒有標記[4]。因此，設計允許抗體（用于免疫熒光）和寡核苷酸（用于原位雜交）滲透到完整器官或同等大小的組織樣本中的方法仍然具有挑戰(zhàn)性。
為了解決這一局限性，麻省理工Dr. Kwanghun Chung課題組開發(fā)了一種稱為SHIELD（stabilization under harsh conditions via intramolecular epoxide linkages to prevent degradation）的方法，以保存器官級透明組織中蛋白質的熒光、蛋白質抗原性、轉錄物和組織結構[5]。SHIELD使用聚環(huán)氧化合物通過形成分子內和分子間交聯來保護生物分子的物理化學性質（例如，蛋白質熒光和抗原性）。經SHIELD固定和脫脂的組織可以承受苛刻的抗體脫色條件，因此可以對同一樣本進行多輪染色和成像。
圖1. 2018年SHIELD榮登《Nature Biotechnology》的封面
此外，Dr.Chung課題組發(fā)展的一系列技術：為了在不損害組織完整性的前提下加速分子標記，發(fā)展了一種新的分子轉運模式，稱為隨機電泳技術（Stochastic electrotransport）[6]，可快速將抗體、染料輸送到致密的組織凝膠中，并允許在2或3天內對完整的小鼠器官進行均勻的染色（而在依賴被動擴散的方法中，則是數周到數月）。為了確保免疫標記的一致性，采用SWITCH技術在整個樣品中同步化學反應。該方法有兩個基本步驟[7]：（1）SWITCH-OFF，當化學物質和緩沖液在組織中自由擴散時，化學反應被抑制；（2）SWITCH-ON，當緩沖環(huán)境迅速改變到允許化學反應的條件時，就可以啟動。以這種方法，組織結構、天然生物分子和抗原性被高度保留，且允許多達≥20輪標記。
圖2. 隨機電泳技術展示對完整的大腦進行均勻和完全的染色
（A、E：主動式隨機電泳；B、F：被動式）
圖3. SWITCH技術展現強大的多輪染色能力
通過結合以上這些強大的技術，LifeCanvas主動式染色儀器SmartLabel（锘海代理）可實現從表面到核心均勻的全器官抗體標記，它的優(yōu)勢還不僅如此：
視頻：采用SmartLabel對小鼠全腦標記NeuN抗體
參考文獻
[1] Ueda HR, Dodt HU, Osten P, Economo MN, Chandrashekar J, Keller PJ. Whole-Brain Profiling of Cells and Circuits in Mammals by Tissue Clearing and Light-Sheet Microscopy. Neuron. 2020;106(3):369-387.
[2] Susaki EA, Shimizu C, Kuno A, et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nat Commun. 2020;11(1):1982.
[3] Ueda HR, Ertürk A, Chung K, et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience [published correction appears in Nat Rev Neurosci. 2020 May;21(5):298]. Nat Rev Neurosci. 2020;21(2):61-79.
[4] Yun D H , Park Y G , Cho J H , et al. Ultrafast immunostaining of organ-scale tissues for scalable proteomic phenotyping. bioRxiv. 660373.
[5] Park YG, Sohn CH, Chen R, et al. Protection of tissue physicochemical properties using polyfunctional crosslinkers. Nat Biotechnol. 2018;10.1038/nbt.4281.
[6] Kim SY, Cho JH, Murray E, et al. Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules. Proc Natl Acad Sci U S A. 2015;112(46):E6274-E6283.
[7] Murray E, Cho JH, Goodwin D, et al. Simple, Scalable Proteomic Imaging for High-Dimensional Profiling of Intact Systems. Cell. 2015;163(6):1500-1514.
經典的免疫熒光和熒光原位雜交分別標記蛋白質和mRNAs的方法，最常用于薄組織切片中，熒光結合的大分子在其中可以快速擴散。通常小組織可以很容易地用分子探針（如抗體）染色；然而，就像所有依賴被動擴散的組織處理方法一樣，大組織的染色需要更長的孵育時間，因此即使在脫脂或水凝膠包埋后，探針也需要數周或數月才能徹底穿透大樣本[3]。
此外，在傳統的被動標記方法中，用于標記的實驗參數（例如孵育時間、探針量）高度依賴于樣品性質（例如組織類型、大小、形狀）和靶蛋白性質（例如表達水平、分布模式），因此，每個實驗都需要費力、昂貴和耗時的優(yōu)化。被動標記的結果在許多情況下是高度不均勻的，外部區(qū)域標記飽和，核心區(qū)域標記較弱甚至沒有標記[4]。因此，設計允許抗體（用于免疫熒光）和寡核苷酸（用于原位雜交）滲透到完整器官或同等大小的組織樣本中的方法仍然具有挑戰(zhàn)性。
為了解決這一局限性，麻省理工Dr. Kwanghun Chung課題組開發(fā)了一種稱為SHIELD（stabilization under harsh conditions via intramolecular epoxide linkages to prevent degradation）的方法，以保存器官級透明組織中蛋白質的熒光、蛋白質抗原性、轉錄物和組織結構[5]。SHIELD使用聚環(huán)氧化合物通過形成分子內和分子間交聯來保護生物分子的物理化學性質（例如，蛋白質熒光和抗原性）。經SHIELD固定和脫脂的組織可以承受苛刻的抗體脫色條件，因此可以對同一樣本進行多輪染色和成像。
圖1. 2018年SHIELD榮登《Nature Biotechnology》的封面
此外，Dr.Chung課題組發(fā)展的一系列技術：為了在不損害組織完整性的前提下加速分子標記，發(fā)展了一種新的分子轉運模式，稱為隨機電泳技術（Stochastic electrotransport）[6]，可快速將抗體、染料輸送到致密的組織凝膠中，并允許在2或3天內對完整的小鼠器官進行均勻的染色（而在依賴被動擴散的方法中，則是數周到數月）。為了確保免疫標記的一致性，采用SWITCH技術在整個樣品中同步化學反應。該方法有兩個基本步驟[7]：（1）SWITCH-OFF，當化學物質和緩沖液在組織中自由擴散時，化學反應被抑制；（2）SWITCH-ON，當緩沖環(huán)境迅速改變到允許化學反應的條件時，就可以啟動。以這種方法，組織結構、天然生物分子和抗原性被高度保留，且允許多達≥20輪標記。
圖2. 隨機電泳技術展示對完整的大腦進行均勻和完全的染色
（A、E：主動式隨機電泳；B、F：被動式）
圖3. SWITCH技術展現強大的多輪染色能力
通過結合以上這些強大的技術，LifeCanvas主動式染色儀器SmartLabel（锘海代理）可實現從表面到核心均勻的全器官抗體標記，它的優(yōu)勢還不僅如此：
- 快速：與被動標記相比，標記完整大組織樣本（例如嚙齒動物器官）要快一個數量級（≤48小時vs.數周至數月）。
- 簡便：只需加載緩沖液、樣品及探針。雙樣本倉設計，可以同時執(zhí)行2個不同的標記實驗。
- 高效：使用少量抗體（低至〜3 µg）即可標記完整小鼠大腦。
- 可靠：利用隨機電泳技術防止組織損傷。專利的納米半透膜有效消除組織污染和探針損失。
- 環(huán)境友好型：緩沖液可以安全地排入下水道。
視頻：采用SmartLabel對小鼠全腦標記NeuN抗體
參考文獻
[1] Ueda HR, Dodt HU, Osten P, Economo MN, Chandrashekar J, Keller PJ. Whole-Brain Profiling of Cells and Circuits in Mammals by Tissue Clearing and Light-Sheet Microscopy. Neuron. 2020;106(3):369-387.
[2] Susaki EA, Shimizu C, Kuno A, et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nat Commun. 2020;11(1):1982.
[3] Ueda HR, Ertürk A, Chung K, et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience [published correction appears in Nat Rev Neurosci. 2020 May;21(5):298]. Nat Rev Neurosci. 2020;21(2):61-79.
[4] Yun D H , Park Y G , Cho J H , et al. Ultrafast immunostaining of organ-scale tissues for scalable proteomic phenotyping. bioRxiv. 660373.
[5] Park YG, Sohn CH, Chen R, et al. Protection of tissue physicochemical properties using polyfunctional crosslinkers. Nat Biotechnol. 2018;10.1038/nbt.4281.
[6] Kim SY, Cho JH, Murray E, et al. Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules. Proc Natl Acad Sci U S A. 2015;112(46):E6274-E6283.
[7] Murray E, Cho JH, Goodwin D, et al. Simple, Scalable Proteomic Imaging for High-Dimensional Profiling of Intact Systems. Cell. 2015;163(6):1500-1514.
Copyright(C) 1998-2025 生物器材網 電話：021-64166852;13621656896 E-mail：info@bio-equip.com