Celigo成像分析技術在細胞殺傷中的應用
如今炙手可熱的PD-1， CAR-T，TCR-T技術等都要歸功于這一偉大發現及其臨床應用。如果你的工作也和免疫療法相關，是不是像小編一樣也有一丟丟自豪，感覺自己參與見證了人類疾病史上的一次飛躍呢？
雞血打滿了，該好好干活了！
無論名字多么fancy的療法，有沒有用還是得看它能否消滅腫瘤細胞。在體外實驗中，抗體或經改造的免疫細胞（效應細胞）對腫瘤細胞（靶細胞）的殺傷是評估療法效價的不可缺少的評判標準之一。多年來，科學家們已開發出了多種免疫細胞殺傷的檢測方法，小編總結如下：
這些方法原理不同，也各有利弊。比如許多實驗室常用的乳酸脫氫酶 (LDH) 釋放法是通過檢測細胞裂解后釋放到培養基中的LDH來反映細胞的殺傷程度的。然而免疫細胞和腫瘤細胞中都含有LDH，死亡后都會釋放到培養基中，因此酶標儀的讀數無法特異性地區分出腫瘤細胞的死亡，結果容易受到死亡的免疫細胞的影響。另外，該方法需設置多組對照，如無釋放組（不加免疫細胞）和最大釋放組（加Triton X-100完全裂解）來確定最低和最高的OD值讀數。如果對照組和實驗組的細胞鋪板密度不均勻，極易造成誤差，甚至出現實驗組殺傷效率為負數的奇怪結果。
再比如Luciferase報告基因法，是將Luciferase的基因片段連接在與T細胞激活相關基因 (比如IL-2或NFAT) 的啟動子之后，通過Luciferase的表達來反映T細胞的激活程度。簡言之是在分子水平檢測T細胞的激活。做該實驗需自行改造T細胞或購買改造好的T細胞系，不夠靈活，具有較大的局限性。
列表中的所有方法還有一個共同缺憾，就是看不到細胞。有圖才有有真相，細胞殺傷連個細胞的影子都沒有，光讓咱們相信這些數字，心里是不是有點虛？實驗失敗了也很難找原因。另外每次實驗只能測一個時間點，想測多個時間點得鋪多塊板，想想就好累！
檢測免疫細胞殺傷有沒有既靠譜又簡單的方法呢？誰說沒有呢？科技的發展日新月異，小編今天就給大家介紹一下做免疫細胞殺傷的最新方法：
Calcein AM染色法
• Calcein AM是一種可以滲透細胞膜的染料，通常用來檢測真核細胞的存活率
• 在活細胞中，本來不發熒光的Calcein AM被胞內酯酶水解后轉化為成發綠色熒光的Calcein
• 在細胞殺傷實驗中，用 Calcein AM標記靶細胞，發出綠色熒光；效應細胞不染色以示區別。當靶細胞裂解后，由于胞內的Calcein釋放到培養基中，細胞失去熒光。通過計算綠色熒光細胞的數量即可得到活靶細胞數和細胞殺傷效率。
*詳細原理可查閱我司Nexcelom Bioscience和德克薩斯大學MD Anderson癌癥研究院合作發表的文獻【1】。
這么好的方法當然需要一個強大的檢測儀器來支撐 – Celigo成像細胞定量分析儀：
● 明場+四色熒光
● 全孔成像，圖片清晰，適用于6-1536孔板
● 定量分析全孔細胞數目
● 軟件自帶流式設門分析功能
● 高速同步成像和分析，15分鐘內完成一塊96孔板的免疫殺傷檢測
現在小編就以NK細胞的ADCC（抗體依賴細胞介導的細胞殺傷）為例子來展示用Celigo做免疫細胞殺傷的效果：
• 全孔成像，分析孔內每一個細胞
• 避免細胞分布不均帶來的局部視野誤差
• 多時間點檢測時，避免因細胞遷移而造成的局部視野前后不一致
• 綠色熒光通道展示被Calcein AM標記的靶細胞
• Celigo軟件將細胞圈定，便于用戶查看細胞識別是否準確
• 在不同時間點將板放入Celigo進行檢測
• 隨著時間的推進，綠色熒光細胞（即活的靶細胞）的數量逐漸減少
*每孔下方數字為0小時綠色熒光細胞密度
• Celigo軟件自動生成每孔綠色銀光細胞隨時間變化的曲線，各孔殺傷情況一目了然
• 原始數據可導出為Excel或GraphPad格式進行后續分析
t0為0小時；t為檢測時間點；treated為加抗體組；control為未加抗體組
• 如上計算公式即可算出每孔的細胞裂解率
• 每孔數據都由該孔0小時和檢測時間點的熒光細胞數相比較得出，不需額外設置對照組，避免了不同孔間鋪板密度的差異造成的誤差
• 根據數據繪制出細胞裂解曲線
• 將明場和綠色熒光圖片疊加，可觀察NK細胞和腫瘤細胞間的相互作用
• 在一定抗體濃度下，隨著時間的推進，NK細胞逐漸在腫瘤細胞周圍聚集，時間越久聚團越明顯，活的腫瘤細胞也越少
• 在相同時間點，隨著抗體濃度的增高，NK細胞逐漸在腫瘤細胞周圍聚集，濃度越高聚團越明顯，活的腫瘤細胞也越少
有了這樣的圖片，你是不是會底氣十足地在組會上匯報：腫瘤細胞真的被免疫細胞殺得片甲不留，此乃我親眼所見！
除了NK細胞, Calcein AM染色法也能運用在PBMC、CIK、中性粒細胞、CAR-T等其他免疫細胞的殺傷。不過呢，Calcein AM也有一個小小缺點，那就是它的熒光半衰期太短，所以該方法只適用于時程較短（< 6小時）的殺傷實驗。如果你的殺傷實驗時程較長也不用擔心，Nexcelom的科學家們早已開發出其他方法來應對各種各樣的實驗條件，需要了解的可以給小編留言噢，我們也會在今后的文章中作詳細介紹，敬請期待！
參考文獻
【1】Somanchi S S, McCulley K J, Somanchi A, et al. A novel method for assessment of natural killer cell cytotoxicity using image cytometry[J]. PLoS One, 2015, 10(10): e0141074.
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