盡管面臨眾多挑戰,多肽和蛋白質藥物口服給藥依然是藥劑學領域的熱點研究方向。多肽蛋白質藥物口服給藥系統的設計有三個關鍵點:保護藥物免遭胃腸道內酶降解、穿越腸黏膜屏障以及促進藥物吸收進入系統循環。目前多肽蛋白質藥物口服制劑已進入臨床應用,納米技術在多肽蛋白質藥物口服給藥中展示了良好的臨床應用前景。該文介紹了多肽蛋白質口服納米載藥系統種類、特點、載體材料以及納米載藥系統口服給藥攝取機制,綜述近年來新發展的幾類新型多肽蛋白質口服納米載藥系統及其作用機制。

多肽蛋白質藥物具有作用靶點專一、生物活性高、不良反應少等特點,目前已有超過60種多肽蛋白質藥物獲美國食品藥品管理局(FDA)批準上市[1]�？诜�給藥是最常見的給藥途徑,但由于多肽蛋白質藥物分子量大,親水性強,穩定性差,以及胃腸道生理屏障的影響,絕大多數多肽蛋白質藥物口服生物利用度低。因此,目前只有干擾素、胸腺素、腦蛋白水解物等少數多肽蛋白質藥物口服制劑批準上市。提高多肽蛋白質藥物口服生物利用度,克服其口服給藥技術難題,多年來一直是國際藥劑學的熱點研究領域。已有各種策略用于改善多肽蛋白質藥物口服吸收,包括藥物結構修飾、蛋白酶抑制劑、吸收促進劑、腸溶包衣和生物黏附技術等[2]。近年來,納米載藥系統成為多肽蛋白質藥物口服給藥領域關注的焦點,納米載藥系統可保護多肽蛋白質藥物免受胃腸道環境破壞,載負藥物跨越腸黏膜屏障,有效提高多肽蛋白質藥物口服生物利用度。筆者系統總結國內外文獻,介紹多肽蛋白質口服納米載藥系統的種類、特點、載體材料以及納米載藥系統口服給藥攝取機制,綜述近年來新發展的幾類新型多肽蛋白質口服納米載藥系統及其作用機制。

1 多肽蛋白質藥物口服給藥困境
多肽蛋白質藥物具有分子量大、易受酶降解、滲透性低以及受胃腸道環境影響易于聚集、吸附、變性等性質,同時,胃腸道具有多種生理屏障,如酸屏障、酶屏障和黏膜屏障等,導致多肽蛋白質藥物口服吸收困難。多肽蛋白質藥物口服后,首先被胃液中的胃蛋白酶降解成氨基酸序列較短的肽,到達十二指腸時pH值增加接近6,部分多肽蛋白質因pH值與其等電點相近導致沉淀。藥物進入腸道后進一步被肽酶降解成小分子肽或氨基酸,酶降解可發生在腸腔內、腸絨毛刷邊、腸細胞的胞漿、細胞內的溶酶體和其他細胞器[3],這是多肽蛋白質藥物失去生物活性的主要原因。

最后一道生理屏障是小腸黏膜系統,主要由小腸上皮細胞和黏液層組成。人胃腸道上皮細胞表面附著多達300 m2的黏液層,由杯狀細胞和黏膜下腺分泌的黏蛋白纖維交聯纏繞而成,充滿水、蛋白質、脂質、電解質、細菌和細胞碎片等[4]。黏液流動水層具有不斷更新的清除機制,不流動水層疏水性強,孔隙為50~1 800 nm,粘蛋白纖維具有靜電作用,阻礙多肽蛋白質等親水性大分子向上皮細胞的擴散[5]。小腸上皮細胞的磷脂雙分子層結構允許脂溶性藥物擴散,細胞間隙約10 Å,只有氨基酸、二肽和三肽能穿過腸膜,大多數多肽蛋白質需要主動轉運才能跨膜進入細胞內[6]。因此,多肽蛋白質藥物由于分子量大,缺乏主動跨膜轉運機制,難以有效地被腸上皮細胞攝取進入循環系統。
此外,部分多肽蛋白質藥物口服后經過肝臟首關效應,以及腸道的刷狀緣、腸內皮細胞溶酶體和膽汁內容物的氧化還原及脫烷基化作用等,導致多肽蛋白質藥物失去活性。

2 多肽蛋白質藥物口服納米載藥系統
近年來,隨著藥物制劑技術的發展,納米載藥系統開始應用于多肽蛋白質口服給藥。納米載藥系統粒徑一般為10~200 nm,多肽蛋白質藥物可以溶解、包裹或吸附于其中避免受到胃酸和消化酶破壞。納米載藥系統可通過細胞旁或腸黏膜派伊爾氏結的M細胞吞噬途徑吸收,也可直接被腸上皮細胞吸收[7]�？诜�納米載藥系統的設計目標是通過控制粒徑大小、表面特性(電荷、親水疏水性等)以及載體形狀等,提高藥物穩定性,促進藥物口服吸收,從而提高藥物口服生物利用度[8]。用于多肽蛋白質口服給藥的納米載藥系統有納米球/納米囊、納米脂質體、固體脂質納米粒(solid lipid nanoparticle,SLN)、聚合物膠束、納米結晶、聚合物藥物復合納米粒等[9]。脂質體的磷脂雙分子層結構和特性與細胞膜相似,易與腸黏膜細胞發生融合、吸附、內吞等作用,增強藥物的腸細胞攝取并在體內緩慢釋放延長藥物作用時間[10]。SLN是采用高壓勻質和微乳技術制備的高效無毒型脂質載體,不使用有毒有機溶劑,用于多肽蛋白質口服給藥有很好前景,SHEN等[11]利用SLN載胰島素經小鼠灌胃給予后其降血糖效果顯著,作用持續了24 h。聚合物膠束是兩親性聚合物在水中自發形成的熱力學穩定體系,粒徑小,性質穩定,制備方法簡單,對包載的多肽蛋白質藥物具有保護作用。膠束作為口服給藥的載體,提高藥物在胃腸道中穩定性,增加吸收部位的藥物濃度,進而提高藥物生物利用度。納米載藥系統常用制備方法包括乳狀液聚合法、界面聚合法等核心方法,以及乳化蒸發法、溶劑置換法和鹽析法等物理化學方法,其中溶劑置換法和鹽析法對多肽蛋白質藥物的生物活性影響較小[12]。

制備納米載藥系統的載體材料包括生物可降解材料如合成或天然高分子材料、脂質等[13],也有無機材料如金屬和金屬氧化物、介孔二氧化硅、納米粘土和碳納米材料等[14]。載體材料的物理特性(大小、形狀)和化學或材料性質(生物黏附性、可降解性、生物安全性等)對納米載藥系統暴露于生理介質中的物理化學性質、黏膜滲透性、藥物有效載荷以及藥物吸收、運載和釋放等有顯著影響。CASTRO等[15]研究發現黏膜黏附性納米載藥系統如殼聚糖或卡波普包衣的脂質體或聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA]納米粒、SLN等能延長多肽蛋白質藥物在胃腸道的滯留時間,具有良好的黏膜滲透性。常用的合成高分子材料有聚乳酸(PLA)、PLGA、聚己內酯(PCL)等聚酯,天然高分子材料有明膠、海藻酸鹽、殼聚糖和多肽蛋白質等。天然高分子材料的降解和釋藥速度比合成高分子材料快。如殼聚糖、果膠、硫酸軟骨素或菊酯等材料易于被結腸微菌群降解,可用于結腸給藥系統。近年來介孔納米材料作為生物大分子藥物載體引起人們重視,如介孔二氧化硅納米載藥系統可通過不同的孔隙大小、形狀、表面積和表面化學修飾等來調節藥物的裝載和釋放行為。SHAHBAZI等[16]開發的納米復合材料以DNA嵌入的多孔硅為核心,PEI-PMVE-MA聚合物為納米殼,并修飾細胞穿透肽(cell penetrating peptides,CPP)。結果顯示該系統生物相容性良好,可以穩定負載并運輸親水型和疏水性藥物,CPP修飾不影響納米復合材料的聚合物性能,同時該納米載藥系統可顯著提高納米粒的膠體穩定性、細胞內化和納米粒的溶酶體逃逸。

3 口服納米載藥系統作用機制
納米載藥系統提高多肽蛋白質藥物口服生物利用度要克服胃腸道的不同生理屏障,尤其是腸黏膜系統屏障,見圖1。黏液層是腸黏膜系統的第一個屏障,納米載藥系統可通過擴散穿越黏液流動層,但黏液不流動水層的黏性和粘蛋白及多糖-蛋白質復合物的相互作用會抵抗納米載藥系統的擴散。納米載藥系統和黏液的相互作用包含靜電作用、范德華力、疏水力和氫鍵作用等,它們影響納米載藥系統的擴散速率和納米載藥系統在黏液層的滯留時間[17]。粘蛋白纖維與納米載藥系統的靜電作用導致粒子聚集進而影響納米載藥系統的傳輸速率,如帶負電荷的羧基和硫酸鹽或中性電荷修飾的納米載藥系統擴散速率比帶正電荷的氨基修飾納米載藥系統高,帶正電荷或巰基的黏膜黏附性納米載藥系統可增加納米載藥系統在黏膜層的保留時間。納米載藥系統表面性質對其穿越黏液層有較大影響,黏膜黏附性納米載藥系統可大量滯留黏液層,從而提高黏膜表面的藥物濃度。但是這類納米載藥系統難以穿透黏液層,即使黏膜層的藥物濃度提高,由于多數多肽蛋白質藥物缺乏主動跨膜轉運機制,因此仍然難以被腸上皮細胞攝取。設計類似于病毒細菌可穿透黏液層的納米載藥系統,在納米載藥系統表面耦聯一層克服黏膜吸附的電中性親水層(高密度的低分子PEG),可在粘蛋白網中擴散并滲透黏液達到上皮細胞表面[18,19]�？傊�,口服納米載藥系統的設計必需考慮納米載藥系統與黏液之間的相互作用,以及納米載藥系統在黏液的可滲透性。尤其是配體靶向的納米載藥系統,必須穿過黏液達到上皮細胞表面才能實現受體靶向作用。

納米載藥系統經過黏液層到達上皮細胞表面后,需要克服納米載藥系統易位和細胞攝取少。研究表明納米載藥系統在小腸的吸收和易位不到1 h,能快速轉移至淋巴管,而微米尺寸的顆粒則易沉積在肺內,在淋巴結轉移取決于吞噬作用[20]。納米載藥系統的細胞攝取徑通常為吞噬、胞飲和細胞旁擴散,除殼聚糖等會影響緊密連接外,一般認為納米載藥系統的攝取主要發生于M細胞或胞飲,M細胞對納米載藥系統的攝取和運輸明顯高于腸細胞。胞飲是由巨胞飲、網格蛋白或小窩介導或依賴的內吞作用引起的[21]。納米載藥系統的物理化學性質會影響胞飲作用,例如粒徑越小胞飲作用就越強[22]。提高納米載藥系統腸細胞攝取的策略:減小粒徑;表面疏水性;表面電荷呈電中性;納米載藥系統表面耦聯靶向配體[23]。



4 新型多肽蛋白質藥物口服納米載藥系統
4.1 靶向肽配體的口服納米載藥系統
靶向分子修飾納米載藥系統是提高其口服吸收的的一種有效方法。納米載藥系統“主動靶向”基于分子的識別過程,即配體受體或抗原抗體相互作用。研究表明,耦聯具有上皮細胞受體或抗體的多肽蛋白質配體納米載藥系統可以顯著增強上皮細胞的攝取和轉運。納米載藥系統通過物理吸附或共價耦聯靶向肽配體,可增加納米載藥系統的轉運并影響細胞攝取方式,如葉酸、白蛋白和膽固醇等配體促進小窩蛋白介導的內吞,乙二醇受體的配體促進網格蛋白介導的內吞[24]。配體影響納米載藥系統的粒徑、形狀和粒子間的空間距,并影響納米載藥系統的表面特性和納米載藥系統與其環境界面之間的性能。

肽配體可通過大規模的化學方法合成或者噬菌體產生,用于各種類型的受體或細胞,如整合蛋白受體、心肌細胞、凝血受體、腫瘤細胞、小腸組織、M細胞和胰腺細胞等。JIN等[25]研究了靶向杯狀細胞的CSKSSDYQC(CSK)肽修飾的三甲基殼聚糖納米載藥系統(TMC NPs)對胰島素體內外口服吸收行為的影響。結果表明,與未修飾的納米載藥系統相比,CSK肽修飾的TMC納米載藥系統可有效促進納米載藥系統在絨毛中的吸收,增強腸上皮細胞的藥物轉運,大鼠口服生物利用度提高1.5倍。Caco-2/HT29-MTX共培養細胞攝取實驗表明,CSK肽修飾的納米載藥系統即使在靶向識別受到黏液影響時,仍能有效促進腸細胞的攝取。研究還發現黏液對于修飾和未修飾的TMC NPs轉運胰島素均有促進作用。SHRESTHA等[26]報道3種不同表面修飾的納米粒如殼聚糖(CS UnNPs)、l-半胱氨酸(CYS-CS UnNPs)或細胞穿透肽(CPP-CS UnNPs)。結果顯示,CYS-CS和CPP-CS UnNPs在細胞內的胰島素表觀滲透率分別增加17和12倍。胰島素在腸細胞的吸收機制通也被闡明是主動轉運過程和靜電相互作用,以及吸附和網格蛋白介導的內吞途徑。糖尿病大鼠灌胃治療結果顯示,與空納米粒和胰島素溶液相比,CPP-CS UnNPs的胰島素相對生物利用度分別增加1.86和2.03倍。

4.2 非肽配體的口服納米載藥系統
靶向肽配體納米載藥系統只有在活性位點或攝取部位蓄積才能有效增強細胞的攝取和轉運,但是,在不斷變化的胃腸環境中納米載藥系統很容易被迅速清除,導致靶向肽配體納米載藥系統的細胞轉運量有限。此外,生物大分子配體納米載藥系統存在粒徑增加和非特異性相互作用減弱難以通過黏液層、部分生物大分子具有免疫原性以及生物大分子耦聯困難、耦聯后生物活性難以保持等問題。采用糖衍生物、擬肽或代謝物等小分子(分子量<1 500)作為配體的口服納米載藥系統具有以下幾個優勢:在胃腸道環境中穩定性更好;不誘導受體表面的類固醇障礙;可通過簡單化學合成耦聯,得到耦聯產物更容易表征;配體靶向可控好;無免疫原性。目前研究的口服納米載藥系統非肽小分子配體包括甘露糖衍生物、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)或亮氨酸-天冬氨酸-纈氨酸(LDV)模擬物、凝集素模擬物(lectin)、脂肪酸和維生素等[27,28]。KE等[29]研究維生素B12對三甲基殼聚糖納米載藥系統(TMC NPs)的胰島素吸收的影響。與未修飾的納米載藥系統相比,維生素B12改性的NPs在Caco-2/HT29-MTX細胞模型中明顯提高藥物的轉運量,其內化機制包括小窩蛋白和網格蛋白介導的內吞途徑。結扎大鼠回腸循環實驗研究表明,與未修飾的納米顆粒相比,維生素B12修飾的TMC NPs可以減少腸腔內殘留的胰島素59%,并增加其對上皮組織的吸收4.8倍。

4.3 蛋白質納米結晶技術
目前世界各地公司已經開發出蛋白質的口服載藥系統見表1。
為了延長蛋白質藥物的保質期,蛋白質藥物通常被凍干成固態形式。但是,凍干的蛋白質藥物常常出現蛋白質聚集和二級結構改變,最終導致藥物失去生物活性。納米結晶技術是保持蛋白質高穩定性和生物活性的方法之一。蛋白質納米結晶(cross-linked enzyme crystal,CLEC®)是一類新型口服納米載藥系統,采用結晶技術使蛋白質藥物形成粒徑為50~500 nm的納米顆粒,通過表面活性劑的電荷或空間穩定化作用使納米顆粒形成穩定的納米混懸液。蛋白質納米結晶可有效保護蛋白質生物活性,生物相容性良好,易降解,可自組裝。CLEC®過程主要由兩個步驟組成,包括蛋白質的結晶化和蛋白質微晶體與戊二醛的化學交聯。CLEC®技術具有以下優點:分離純化蛋白質的有效方法;適合于高劑量需求的蛋白質藥物;蛋白質的晶體穩定性遠高于其溶解型或無定形狀態的穩定性[30,31]。另外,部分蛋白質不容易結晶或無法形成結晶狀態,或者結晶型的蛋白質生物活性低,因此,需要對制備蛋白質結晶的輔料和工藝進行優化,才能確保蛋白質的高活性和穩定性。GRUJIC等[32]報道在兩個小鼠模型(AGT1基因敲除或未敲除)口服草酸脫羧酶(OxDc-CLEC®)可減少尿草酸(44%)和腎損傷,降低高氧尿癥,預防鈣、草酸鈣和尿石癥。

4.4 Eligen®載體技術
Eligen®技術是Emisphere科技公司開發的適合于多肽蛋白質等載體生物大分子的口服載藥系統。該技術采用具有促吸收功能的N-8-(2-羥基苯甲酰)氨基鹽(SNAC)與藥物分子結合形成微弱的非共價復合物,確保在不改變藥物結構、不破壞上皮細胞膜或不產生新毒性的情況下增加藥物的腸吸收[33]。Eligen®載體技術用于口服載藥的作用機制主要是蛋白質構象的可逆變化以及防止藥物被胃腸降解的作用。多肽蛋白質藥物和載體材料產生的非共價相互作用會改變多肽蛋白質藥物的物理化學性質(如親水性、構象、穩定性等),但這種作用是可逆的。當非共價復合物將藥物經上皮細胞運輸到血液循環后,載體材料與藥物分離,藥物恢復具有生物活性的原生構象。相比傳統的促吸收劑具有的破壞細胞緊密連接、改變膜流動性以及增加毒性等作用,Eligen®載體技術對腸上皮細胞的組織損害小。Eligen®載體技術目前擁有超過1 800個不同物理化學性質的載體材料,大部分的材料為小分子氨基酸(分子量 250~350)。Eligen®載體技術已被開發用于各種類型的口服制劑,包括液體制劑、片劑和膠囊。目前進入臨床試驗的多肽蛋白質藥物有鮭降鈣素、肝素、胰島素、甲狀旁腺激素、人類生長激素和色甘酸鈉[34]。ABBAS等[35]研究發現10名健康志愿者口服胰島素與SNAC的復合物后,胰島素被迅速吸收進入系統循環,并在25 min內達到血漿濃度峰值。在2型糖尿病患者臨床研究中,標準餐前30 min服用含有10 mg胰島素和200 mg SNAC的胰島素膠囊的患者,其系統循環的胰島素水平顯著增加。目前,已開展Eligen®技術應用于多肽蛋白質藥物口服給藥的人體臨床試驗研究。

5 結束語
目前的研究表明,納米載藥系統的結構和性質具有多樣性,可有效克服體內胃腸道生理屏障,提高多肽蛋白質藥物口服生物利用度,是理想的口服給藥載體。但是要實現多肽蛋白質藥物口服納米載藥系統的臨床應用,還需要開展大量的基礎和應用研究工作,如闡明納米載藥系統體內生物藥劑學和毒理學作用機制,研制安全、經濟的口服納米載藥系統功能性輔料,建立完善的納米載藥系統質量評價體系和質量標準,開發可工業化的制備技術和設備等。相信隨著研究的不斷深入,納米載藥系統將成為實現多肽蛋白質口服給藥的重要技術。