實時熒光定量PCR檢測方法-SYBR Green I 法與TaqMan 探針法

瀏覽次數：4553　發布日期：2020-6-18　來源：本站　僅供參考，謝絕轉載，否則責任自負

來自美國Azure Biosystems公司的Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統，融合了高品質Pilter溫度模塊和基于光纖傳輸的光學檢測系統，為您的科學研究提供高精準、高靈敏的可靠結果。北京深藍云生物科技有限公司已經為您準備好了儀器，期待您的試用哦~

既然儀器已經備好了，那么該怎樣選擇檢測方法呢？

眾所周知，qPCR依托于熒光檢測技術，通過使用DNA結合染料、熒光PCR引物或探針等實時監測目的基因的擴增，從而對目的基因進行定量分析。為了避免在實驗時出差錯，下面就跟著小編一起來看一下常用的經典方法吧~

1、 DNA結合染料—SYBR Green I 法

• 原理：SYBR Green I 是一種DNA結合染料，其與雙鏈DNA結合后，熒光大大增強，DNA與染料結合所釋放的熒光量與dsDNA的數量成正比。因此，檢測到的熒光信號可反映出PCR體系存在的雙鏈DNA數量。

• 特征：可逆熒光，最大吸收波長497nm，最大發射波長520nm。

• 適用情況：非特異性的熒光染料，不能識別特定的雙鏈，只要是雙鏈（包括非特異性擴增產物、引物二聚體等）就會結合發光，在臨床上使用可能會有假陽性發生。但該方法容易建立實驗體系，可進行熔點分析，通用性好，價格相對較低，在科研中使用比較普遍。

2 、TaqMan 探針法

• 原理：檢測時除了需要一對特異性引物外，還需要一條與靶序列互補配對的寡核苷酸鏈—TaqMan探針，其5’末端包含熒光報告基團R，3’末端為淬滅基團Q。當探針與靶序列互補配對時，熒光基團發射的熒光因與3’端的淬滅基團接近而淬滅。在進行延伸反應時，聚合酶的5’核酸外切酶活性將探針切斷，使得熒光基團與淬滅劑分離，發射熒光。熒光信號和產物的量相匹配。

• 特征：檢測到的是積累熒光，隨著循環數的增加，釋放出來的熒光基團不斷積累。

• 適用情況：特異性較強，可進行多重qPCR分析，但成本較染料法要高一些，實驗構建相對復雜。常用的熒光基團推薦：FAM、VIC、HEX、CY5等。

3 、分子信標(molecular beacon)

• 原理：分子信標方法在檢測時除了需要一對引物以外，還需要一條呈發夾結構的寡核苷酸探針（25-40nt），分子信標的 5'端附有熒光報告基團，3'端附有淬滅基團，環被設計成與靶序列互補的15–30核苷酸，其兩端各有5-7個核苷酸互補形成莖結構，將報告基團與淬滅基團連接到一起。發夾結構中，由于報告基團接近淬滅基團，監測不到熒光信號，當環的部分與核酸序列互補配對，分子信標打開成鏈狀，使得熒光基團與淬滅劑分開，發射熒光。

• 特征：莖環結構，也是積累熒光。

• 適用情況：高特異性、可以用于多重反應，適合區分等位基因。但不能做熔點分析；發夾的莖結合過強過弱都不合適，過強的話，信標不能與靶標正確雜交，過弱的話，會隨機折疊成非發夾結構，導致產生雜信號。常用的熒光基團有FAM 、Texas Red等。

4 、熒光共振能量傳遞(FRET)

• 原理：FRET探針又稱雙雜交探針，由兩條相鄰探針組成。第一個探針3'端帶有供體基團，第二個探針的5'端帶有受體基團，在PCR反應的退火步驟，兩條探針頭尾相連地分別雜交在靶標序列上，熒光分子接近，從供體到受體產生熒光共振能量傳遞，受體熒光信號的增加與擴增子出現的量成比例。

• 特征：由于FRET探針是靠近發光，所以檢測信號是實時信號，而非積累熒光。

• 適用情況：除引物外需要設計兩條探針，通用性不高；需挑選合適的供體及受體基團，供體基團發射波長與受體基團的激發波長需顯著重疊，而供體基團發射波長與受體基團的發射波長要明顯分離。可做熔點分析，特異性較強。

5 、 LUX Primers

• 原理：LUX (light upon extention) 引物是通過熒光標記的引物，使引物可以實現探針的功能。其原理和分子信標類似，LUX引物也是發夾結構，其中一條引物3’端用熒光報告基團標記。在沒有單鏈模板的情況下，該引物自身配對，形成發夾結構，使熒光淬滅。在模板存在的情況下，引物與模板配對，發夾結構打開，產生熒光信號。

• 特征：積累熒光；不需要額外設計探針。

• 適用情況：不能進行熔點分析，通用性比不上SYBR Green I。但不需要專門設計探針，同時不會受非特異性擴增產物和引物二聚體的影響，特異性較SYBR Green I強。

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