FluorCam多光譜熒光成像技術應用案例—多光譜熒光成像是什么
1. 多光譜熒光的發現及特性
二十世紀八九十年代，植物生理學家對植物活體熒光——主要是葉綠素熒光研究不斷深入。激發葉綠素熒光主要是使用紅光、藍光或綠光等可見光。當科學家使用UV紫外光對植物葉片進行激發，發現植物產生了具備4個特征性波峰的熒光光譜。
圖1. 左：煙草葉片上表面UV激發熒光光譜（Buschmann，1998）；中：多光譜熒光彩色光譜示意圖；右：不同顏色激發光的熒光激發特性（Benediktyová, 2009）
這4個特征性波峰的波長分別為藍光440nm（F440）、綠光520nm（F520）、紅光690nm（F690）和遠紅外光740nm（F740）。這個特征激發熒光光譜就稱為多光譜熒光（Multi-color Fluorescence，MCF）。其來源和熒光特性請見表1。
表1.UV激發多光譜熒光特性（Buschmann，1998，略有修改）
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A．藍綠熒光（Blue-Green Fluorescence，BGF） |
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熒光色素： |
主要是細胞壁中共價結合的阿魏酸，由液泡中的肉桂酸和類黃酮調控 |
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位置和來源： |
a）細胞壁（主要來自于葉片表皮） b）液泡（與溶解的酚類有相互作用） |
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激發： |
UV |
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熒光特性： |
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輻射范圍： |
400-570nm |
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最大值（波峰）： |
440-450nm（藍光，F440），520-530nm（綠光，F520） |
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脅迫指示： |
藍色熒光與紅色和遠紅熒光比例：F440/F690，F440/F740的增加或減少；某些植物中綠色熒光的增加 |
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B．葉綠素熒光（Chlorophyll Fluorescence，Chl. F） |
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熒光色素： |
葉綠素a |
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位置和來源： |
葉片葉肉細胞，葉綠體 |
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激發： |
紅光、綠光、藍光、UV等 |
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熒光特性： |
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輻射范圍： |
650-800nm |
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最大值（波峰）： |
690nm（紅光，F690），730-740nm（遠紅光，F740） |
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脅迫指示： |
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短期脅迫： |
熒光誘導動力學變化（通過葉綠素熒光技術進行分析），F690/F740增加30% |
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長期脅迫： |
熒光誘導動力學變化（通過葉綠素熒光技術進行分析），葉綠素含量減少，F690/F740大幅增加。F690/F740是原位葉綠素含量的反向指標。 |
2. 多光譜熒光的發展
進一步的研究發現，并稱為藍綠熒光（Blue-Green Fluorescence，BGF）的F440和F520在正常生長的植物中強度很低。而在植物受到脅迫尤其是病害感染后，其強度才會顯著上升。
與來源于光系統的葉綠素熒光不同，藍綠熒光來源于一系列植物次生代謝物質，包括多酚、植保素、黃酮類、阿魏酸、苯丙素類等。這類物質在植物生長狀態良好時含量很低，植物只有在受到脅迫后才會大量合成，這一方面是由于初級代謝受到抑制和干擾，另一方面這些次生代謝產物也是植物應對脅迫尤其是病害防御機制的重要組成部分。
F690和F740則屬于葉綠素熒光，其強度與葉綠素含量和光合電子傳遞相關。F690 ⁄ F740認為與葉綠素濃度成負相關。同時F440 ⁄ F690，F440 ⁄ F740可以作為極早期脅迫指示指標，F440 ⁄ F520則反映長期脅迫變化（Pineda, 2008）。
3. FluorCam多光譜熒光成像技術
FluorCam多光譜熒光成像技術是在國際知名FluorCam葉綠素熒光成像技術基礎上擴展升級而來的。這是目前國際上唯一能夠進行多光譜熒光成像分析的商用科研儀器技術，而且也是唯一將多光譜熒光成像技術和葉綠素熒光成像技術結合為一體的商用科研技術。
目前，基于FluorCam多光譜熒光成像技術有三款儀器系統，分別為FluorCam一體式多光譜熒光成像系統、FluorCam模塊式多光譜熒光成像系統、FluorCam落地式大型多光譜熒光成像平臺，用于滿足不同的實驗需求。
圖2. 左：FluorCam一體式多光譜熒光成像系統；中：FluorCam模塊式多光譜熒光成像系統；右：FluorCam落地式大型多光譜熒光成像平臺
FluorCam多光譜熒光成像系統除了可以進行多光譜熒光成像和葉綠素熒光成像分析，還可以擴展GFP成像、PAR吸收率成像、NDVI成像、QA再氧化成像、OJIP成像等成像分析功能。
FluorCam多光譜熒光成像系統與紅外熱成像、高光譜成像等其他植物表型成像技術結合，已經廣泛應用于植物病害（細菌、病毒、真菌）、干旱、養分虧缺、重金屬、除草劑等脅迫造成的次生代謝與表型組學研究，其中植物病害表型為最主要的研究方向。
圖3.左；細菌性甘薯莖腐病感染煙草的FluorCam葉綠素熒光與多光譜熒光成像分析；右：丁香假單胞菌感染菜豆的FluorCam多光譜熒光成像分析（Pérez-Bueno, 2016, 2015）
參考文獻：
1. Buschmann C, Lichtenthaler HK. 1998, Principles and characteristics of multi-colour fluorescence imaging of plants, Journal of Plant Physiology, 152: 297-314
2. Benediktyová, Z. & Nedbal, L. 2009. Imaging of multi–color fluorescence emission from leaf tissues. Photosynthesis research 102, 169-175
3. Pineda M, et al. 2008, Multicolor Fluorescence Imaging of Leaves—A Useful Tool for Visualizing Systemic Viral Infections in Plants, Photochemistry and Photobiology, 84: 1048-1060
4.Pérez-Bueno M L, et al. 2015, Spatial and temporal dynamics of primary and secondary metabolism in Phaseolus vulgaris challenged by Pseudomonas syringae, Physiologia Plantarum 153: 161-174.
5.Pérez-Bueno M L, et al. 2016. Temporal and Spatial Resolution of Activated Plant Defense Responses in Leaves of Nicotiana benthamiana Infected with Dickeya dadantii. Front Plant Sci. 6: 1209
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