奧豪斯高通量組織gDNA提取實踐手冊
轉眼間就到2020年了
小奧課堂又帶著滿當當的知識來咯
今天小奧和大家分享的依然是
干貨滿滿的生物研究實踐手冊
祝大家新年愉快！
Part 1
—— 前 言 |
組織gDNA提取和純化是分子生物學的基本實驗技術，其原理和操作絕大數生物學相關的研究人員都有接觸。
困擾實驗人員的是當樣本量過大時，以1.5ml離心管為基本體系的組織核苷酸提取模式，同時操作20個以上的樣品有非常繁瑣的實驗過程和樣品間有錯亂或者交叉污染的風險，此篇筆者介紹一種以微孔板為基本體系，借助樣品均質器和微孔板離心機為基本體系的高通量半自動化提取和純化體系，該體系極大的增加了研究人員的實驗效率。
Part 2
- 原理解析 -
核苷酸提取和純化的基本原理
核苷酸提取和純化的一般過程包括裂解組織細胞，并使細胞內的核酸酶如DNase 和 RNase失活，然后從細胞裂解液中得到核苷酸成分并分離純化出來。
在裂解組織細胞時，細胞裂解液的選擇是非常關鍵的因素，商業化的裂解液有很多中不同的種類，其組分和組分的配比有非常大的不一樣，由于不同機體組織結構的差異如植物細胞有細胞壁而動物細胞沒有，需要選擇不同類型的裂解液來提高gDNA的提取效率。
裂解液的作用包括以下幾個方面：
1. 裂解細胞膜和核酸膜
2. 裂解液保持gDNA結構的完整性
3. 裂解液能夠使gDNA能夠從細胞碎片中分離，并防止其被酸降解。
4. 在gDNA提取過程中保持裂解液中穩定的PH值。
細胞裂解液的主要化學成分包括Tris, EDTA, SDS, CTAB, Triton X100, MgCl2, KCl, NaCl和其它的洗滌劑。
首先Tris, EDTA是細胞裂解液的主要成分，俗稱TE buffer, Tris能夠維持裂解液穩定的PH值而EDTA是二價金屬離螯合劑，主要作用是使DNase 和RNase 失活； 其次，SDS和CTAB的作用是能夠裂解細胞膜，使細胞膜和核膜上的蛋白質失活，再者一些鹽類如MgCl2能夠阻斷脂蛋白的負電從而保護DNA，KCl, NaCl能夠中和負電的DNA使DNA較易從細胞中拉出來。
當然細胞裂解時可能也會使用到Triton X100，beta-mercaptoethanol, ascorbic acid等試劑。
值得注意的是，在組織gDNA提取的過程中，通常還會采用Proteinase K蛋白酶進行前處理，采用Proteinase K進行DNA提取的方法到目前為止常用的DNA提取方法之一。
蛋白酶K是一種從白色念珠菌分離出來的強力蛋白溶解酶，具有很高的比活性，是DNA提取的關鍵試劑。該酶在較廣的pH值范圍（4-12.5）內以及高溫（50-70攝氏度）均具有活性。EDTA等螯合劑或SDS等去垢劑均不能使之失活。
蛋白酶K是一種切割活性較廣的絲氨酸蛋白酶，它切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽鍵。蛋白酶K能夠消化細胞膜和核膜上的各種膜蛋白糖蛋白，同樣也能消化和DNA結合的組蛋白。
核苷酸的分離純化的方法有很多種，很多方法都有商業化的試劑盒提供，現在較為通用的是固相gDNA核苷酸分離純化的方法，包括以下幾個關鍵的步驟：
1. 細胞裂解液中的gDNA在固相表面的吸附
2. 清洗固相表面，去除固相表面非gDNA的雜質
3. 將gDNA從固體吸附表面洗脫下來得到較純的gDNA
關于固相表面多為二氧化硅材質，依附在柱子（column）的形式或者磁性微球（bead）的形式，帶正電的二氧化硅類材料對帶負電的DNA骨架有很強的結合力，鈉離子在兩者之間起到了陽離子橋的作用。
在pH小于7的情況下，高濃度的鈉陽離子打破了二氧化硅材料帶負電氧離子和水溶液氫離子的氫鍵結合，使得DNA能夠牢牢地綁在二氧化硅材料上，大量地洗滌能夠去除吸附在二氧化硅材料上地DNA以外地其他污染物。
低的離子濃度和pH大于7的情況下，DNA和二氧化硅材料表面的結合力變得十分微弱，較純的DNA可以從二氧化硅材料表面采用TE緩沖液或者單純用蒸餾水洗脫下來。
Part 3
- 實例分享 -高通量組織gDNA提取方案分享
1. 將組織切成25mg左右的小塊（脾臟組織最多10mg）放入合適的奧豪斯預填充均質裂解管中（針對不同來源的組織裂解管中含有對應直徑的鋯珠能夠對組織進行有效的切割），
加入0.5ml TE buffer,使用奧豪斯高通量生物樣品均質器，設置研磨時間為5分鐘，研磨速度1500rpm，樣品過多可使用深孔板進行裂解。
2. 裝載組織裂解液的96孔板中每孔加入10ul proteinase K(20mg/ml),混勻，56℃度下孵育1-3小時直至組織完全裂解。（在孵育過程中渦流混勻效果更佳）。如果需要RNA-free的DNA樣品，在孵育完后可平衡到室溫后加入RNase消化2分鐘。
3. 根據高通量DNA試劑盒的手冊，將合適量的裂解液和乙醇加入裝載組織裂解液的96孔板中，15s混勻。
4. 96孔連接的DNA結合柱子套上深孔96孔板，將混勻后的裂解液（包括任何的沉淀物）一一對應轉移到DNA結合的柱子上，用離心機將96孔板8000rpm離心一分鐘。
5. 離心后棄深孔板中的廢液，加入試劑盒提供的洗滌液500ul到DNA結合柱子，8000rpm離心一分鐘。如果洗滌液有兩種，操作兩次。
6. 離心后棄深孔板中的廢液，96孔板14,000 rpm離心3分鐘使酒精揮發。
7. 棄裝廢液的深孔板，在DNA結合柱子表面下換上干凈的96孔板，加入100ul TE緩沖液或者微熱的雙蒸水到DNA結合柱子表面，放置2分鐘以使TE/水浸潤，8000rpm離心一分鐘。
8. 用微量分光光度儀檢測96孔板中DNA的OD值A260,A280和A320,得到純度和濃度信息。
Part 4
- 展望 -DNA提取和純化技術有賴于目前成熟商業化的試劑盒已成為生物科學實驗室常規的實驗技術。
但當樣品量過大時，特別是操作難度較大的組織樣品時，以常規的1.5ml離心管為體系的gDNA提取和純化技術依舊是一個費時費力的過程，需要很長的時間和體力勞動，多批次進行提取，這樣一個過程有極大的樣品混淆，交叉污染的風險。
利用現有的一些便利的儀器和材料如96孔板，96孔DNA結合柱，奧豪斯高通量生物樣品均質器進行gDNA提取和純化將整個過程變得半自動化，將有效的規避前面描述的這些風險，是提高實驗室gDNA提取效率和質量的常用的解決方式，也是未來gDNA提取和純化的發展方向。
