在RPLC模式下，可再現保留所需的典型柱平衡約為10倍柱體積。

圖14中可清楚反映這一點
但是，對于HILIC分離則不同。通常，HILIC色譜柱的平衡時間比RPLC色譜柱的更長。

這是該技術的一個特點，也是可再現保留所必需的。
在固定相粒子周圍建立和形成穩定的水合層對可再現HILIC色譜法很重要（HILIC色譜法的重現性至關重要）。

所花費的時間也因相位（固定相）特性、洗脫劑和分析物而各有不同，因此取決于具體應用。

下面的指導原則可用作近似法（近似的參考）。

重要的是：在HILIC方法開發中，平衡將作為各項分離的一個參數進行研究（對于每一個成熟的分離方法，在HILIC方法開發時，平衡時間都將作為一個參數進行研究）。
對于全新的未使用色譜柱，建議使用60-80倍柱體積，以在最初建立HILIC所需的水層。

圖14
RPLC和HILIC模式中達到全新未使用色譜柱所需的柱體積數的對比

一旦建立水層，可實現可再現（重現性）和一致的保留和色譜法（可實現色譜方法的重現性，一致的保留時間）。
運行完成后，應清洗色譜柱并根據第9節中相關指導說明儲藏。

對于色譜柱第二次以及之后的每次運行，建議只采用20倍柱體積，以達到穩定的保留次數（時間），見圖15。

圖15
HILIC模式中第二次及隨后每次分析達到平衡所需的柱體積數對比
色譜柱：ACE 5 HILIC-A,
100 x 3.0 mm
流動相：10 mM甲酸銨，pH4.7（溶于MeCN/H2O中）（90:10 v/v）
流速：0.43 mL/min
溫度：25 °C
檢測：UV, 214 nm
樣本：
1) 2’-脫氧鳥苷
2) 4-羥基苯甲酸
3) 沙丁胺醇

梯度HILIC平衡

同時，ACE HILIC相也可以使用可再現梯度HILIC法（ACEHILIC色譜柱也可重現HILIC方法的梯度洗脫）。

經確定，兩次進樣之間大約需要10倍柱體積。兩次進樣之間的平衡時間低于新色譜柱所需的時間，因為只需要重新建立起始條件。

新色譜柱需要平衡，以在固定相顆粒上形成水合層（而新色譜柱需要長時間平衡，是因為需要在固定相顆粒上形成水合層）。

圖16
顯示了兩次進樣之間使用20倍柱體積平衡情況下，兩次連續進樣梯度HILIC分析的極佳保留再現性。