文章導讀
LncRNA是長度大于200nt的長鏈非編碼RNA，在調控不同的分子過程中發揮著重要作用。其主要功能不僅可以與功能蛋白結合，并在轉錄或轉錄后水平調控基因表達，而且lncRNA也可以作為誘餌，吸附miRNA，調節miRNA調控的靶基因表達。但是，目前關于lncRNA在胃癌中的表達譜和生物學功能的了解仍然有限；在本研究中，作者首先通過生物信息學分析胃癌lncRNA微陣列數據庫，發現LINC0034在胃癌中顯著高表達，且與胃癌具有臨床相關性，結果顯示顯示LINC00346在胃癌中反復擴增上調，其表達與病理分期差、腫瘤體積大、預后差呈正相關。然后探究了 LINC00346的體內外功能，實驗顯示LINC00346能夠影響胃癌生長、遷移和侵襲等生物學功能。作者也探究了LINC00346調控胃癌發展的上下游分子機制，上游機制顯示致癌轉錄因子KLF5和MYC可與LINC00346啟動子結合，并增強其表達；下游機制顯示LINC00346主要表達在胞質中，可通過ceRNA機制作為miR-34a-5p的分子海綿體，并通過吸附miR-34a-5p后調節其下游靶基因CD44、AXL、NOTCH1的表達并調控胃癌細胞的生物學功能。
綜上所述，該研究結果證明了KLF5、MYC/LINC00346/miR-34a-5p在胃癌發生發展中起關鍵作用的模型，為胃癌治療提供了新方向和思路。

發表期刊：Cell Death & Differentiation
影響因子：8.0
實驗方法：生信高級分析，轉錄組RNA測序，RIP，pulldown（云序生物提供）
測序樣本：過表達LINC00346的胃癌細胞（實驗組），轉染空載質粒的胃癌細胞（對照組）

結果：LINC0034具有胃癌臨床相關性
a,b：LINC0034在胃癌中顯著高表達；c-d：LINC0034的表達與病理分期差、腫瘤體積大、預后差呈正相關。

結果1：體外探究LINC00346對胃癌細胞增殖、遷移和侵襲功能影響
a-b．克隆形成實驗探究細胞增殖能力；c. 流式細胞術實驗探究細胞周期組織情況；d. EDU免疫熒光染色實驗探究細胞增殖能力；e. Transwell和invasion實驗探究細胞遷移和侵襲能力。

結果2：體內探究LINC00346對胃癌在體內的生長和轉移的影響
a-h：裸鼠成瘤實驗

（1）LINC00346調控胃癌發展的上游機制
結果：轉錄因子KLF5和MYC可與LINC00346啟動子結合，并增強其表達
a. 轉錄因子MYC、KLF5和 LINC00346的Oncoprint分析；b. 在含有或未含有胃癌KLF5/ MYC / LINC00346 SCNAs的轉錄因子KLF5、MYC、LINC00346基因表達；c. GSE51705數據庫的分析顯示，KATO-III GC細胞中KLF5與LINC00346基因啟動子結合；d. UCSC基因組生物信息學網站顯示， MYC高度富集在LINC00346的啟動子上；e. GSE51575數據庫顯示LINC00346的表達與KLF5或MYC正相關；f. qPCR顯示LINC00346的表達與KLF5或MYC 正相關；g. ChIP實驗顯示，內源性MYC和KLF5與LINC00346基因啟動子區結合。h. WB顯示干擾或過表達LINC00346后，KLF5和MYC蛋白表達情況；i. 雙熒光報告實驗檢測LINC00346啟動子片段與KLF5或MYC直接結合

（2）LINC00346調控胃癌發展的下游機制
結果1：GSEA和GO分析LINC00346高/低表達胃癌患者和細胞
a. GSEA分析GSE65801數據中比較LINC00346高/低后差異基因的富集信號通路； b. 熱圖顯示胃癌中過表達LINC00346后的差異基因；c. GO分析差異基因的富集情況；d,e. qPCR和WB篩選腫瘤相關的差異基因。

結果2：LINC00346通過調節Notch1、CD44和AXL促進胃癌細胞增殖和侵襲
a.IHC分析腫瘤組織和腫瘤肺轉移組織中Notch1, CD44, 和AXL的表達；b. qPCR檢測胃癌發生或未發生淋巴結轉移組織中Notch1, CD44, 和AXL的表達；c. IHC檢測胃癌發生或未發生淋巴結轉移組織中Notch1, CD44, 和AXL的表達；d. WB檢測胃癌細胞中Notch1, CD44, 和AXL的蛋白表達；e,f. Transwell實驗檢測Notch1, CD44 或 AXL對LINC00346侵襲功能的挽救能力；g. MTT和h.克隆形成實驗檢測Notch1, CD44 或 AXL對INC00346增殖功能的挽救能力。

結果3：LINC00346通過與miR-34a-5p相互作用調控Notch1、CD44和AXL
a. LINC00346和miRNA結合位點的預測；b. MS2-RIP實驗驗證LINC00346能夠拉下的miRNAs；c. pull-down實驗驗證LINC00346吸附的miRNAs；d. 雙熒光報告基因實驗miR-34a與LINC00346直接結合；e. AGO2 RIP實驗驗證miR-34a能夠拉下LINC00346；f. WB顯示miR-34a能夠挽救LINC00346對Notch1, CD44 或 AXL的蛋白水平的調節；g. Tranwell實驗顯示miR-34a能夠挽救LINC00346對胃癌細胞遷移和侵襲能力的調節；h. 雙熒光報告基因實驗顯示miRNA能與Notch1, CD44 或 AXL基因的3‘UTR直接結合； i. 原位雜交實驗顯示LINC00346和miR-34a能夠共定位在細胞質中。

總結
本研究通過生物信息學分析、功能實驗和分子機制探究實驗技術揭示了胃癌發展中一個潛在的新機制：在胃癌的發展過程中，轉錄因子KLF5和MYC結合LINC00346啟動子區，并促進其表達；在胃癌中高表達的LINC00346主要定位在胞質中，并競爭性吸附miR-34a-5p，抑制miR-34a-5p對其下游靶基因（Notch1, AXL, 和CD44）的調控，最終導致了胃癌的惡化發展。LINC00346對胃癌細胞的促增殖和轉移的多效性作用提示LINC00346可作為胃癌的有效治療靶點。

全文鏈接：
https://doi.org/10.1038/s41418-018-0236-y

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