題目：Histological, Physiological, and Comparative Proteomic Analyses Provide Insights into Leaf Rolling in Brassica napus
期刊：Journal of Proteome Research
影響因子：4.268
合作技術：iTRAQ
 
研究背景
    葉片是大多數植物光合作用的主要器官，葉片發育影響作物產量和植物結構。適度的卷葉被認為是作物理想型育種的一個重要組成部分，它能夠改變植物的結構，提高光合效率，延緩葉片衰老，減輕干旱、高溫和高光等脅迫帶來的損害。近年來，在擬南芥和水稻等物種中，已經分離出了卷曲葉片突變體，并對它們的分子機制進行了深入的研究。油菜作為世界上最重要的油料作物之一，雖然也發現了一些卷曲葉片的突變體，但是對于其作用機制仍有待進一步的研究。
    本文作者主要利用iTRAQ定量蛋白質組學技術分析油菜卷葉突變株Bndcl1與野生株（WT）的差異蛋白，闡明了卷葉機理及其對植物的生理影響，有望促進油菜的理想株型育種。
 
研究內容及結果
1. 本研究中，作者選取了油菜卷葉突變株Bndcl1，首先經組織學對比發現，相比于野生株（WT），突變株（Bndcl1）幼苗期的葉片表型上比較緊湊（圖 1A和B）。組織切片結果中發現Bndcl1葉綠體數目明顯增多，特別是在海綿狀的葉肉細胞中(圖1C和D)。此外，作者發現，在Bndcl1突變體中，在遠軸端韌皮部組織細胞較少，而在其葉脈以下的遠軸端表皮細胞明顯增大(圖1E和F)。

圖1.葉片的組織學分析                               
2. 為了評估卷曲葉片對Bndcl1突變株光合性能的影響，作者測定了Chl的含量、Chl熒光和氣體交換參數。與野生株相比，Bndcl1株中的葉綠體數量、PSII和凈光合速率的有效量子產量顯著增加。

3. 活性氧(ROS)的生成在光合作用的光反應過程中是不可避免的，PSII極易受到光破壞的影響。光抑制的光合作用不可避免的損失會因ROS的產生而加劇，而ROS的產生會減慢PSII的修復。為了減少光氧化傷害，光合生物體已經進化出多種機制，而對抗氧化劑的上調是調節機制的一部分。因此，作者檢測了Bndcl1和WT葉子的酶活性、脂質過氧化和ROS水平，發現在Bndcl1葉片中O2• − 和H2O2較低，由此說明其ROS水平也將明顯降低(圖2A和B)。此外，TBARS在突變株的低水平同樣說明其膜脂過氧化的水平降低(圖2C)。作者還檢測比較了兩者的SOD、POD和CAT酶活性，發現相比于WT株，在Bndcl1葉片中此酶活性顯著增加。由此說明Bndcl1的光系統能更好的避免受到光氧化傷害。

圖2. 野生株（WT）和突變株（Bndcl1）的葉子酶活性、脂質過氧化和ROS水平            

4. 作者應用iTRAQ定量蛋白質組學技術研究Bndcl1與WT葉片蛋白質表達水平的差異，總共鑒定到5019個蛋白，差異蛋白有943個，其中發生上調的蛋白有451個，發生下調的蛋白有492個。作者對這些蛋白進行了GO、COG、KEGG等注釋分析。通過對差異蛋白中發生上調和下調的蛋白分別進行GO分析并對比發現，在“細胞增殖”、“生物過程的調節”、“色素沉著”等功能方面，下調的蛋白數目要比上調的蛋白數多，具有抗氧化活性的功能的上調蛋白數目是下調蛋白數目的3倍多（圖3）。COG分析表明，大多數下調蛋白參與翻譯、核糖體結構和生物發生，而上調蛋白主要參與碳水化合物的運輸和代謝、轉錄翻譯后修飾、蛋白質的周轉、分子伴侶和能量的產生和轉化（圖4）。KEGG 注釋結果顯示，盡管在“代謝途徑”、“次生代謝產物的生物合成”和“淀粉和蔗糖代謝”中均有上調和下調的蛋白質參與，但在不同的途徑中也涉及到不同差異蛋白質（圖5）。

圖3.差異表達蛋白的GO功能注釋分析                               
 
    
圖4. 差異表達蛋白的COG注釋分析                       

       圖5. 差異表達蛋白的KEGG富集分析                        
 

5. 為了進一步對這些差異蛋白的功能進行分類分析，作者進行了功能富集分析。通過對差異蛋白的富集分析結果發現，這些發生上調的蛋白能夠改善Bndcl1株的光合性能和減輕氧化傷害，并且發現下調的蛋白參與了葉片近-遠軸極性建成。
6. 作者最后從差異表達蛋白中挑選了多個蛋白進行了qRT-PCR表達驗證。例如：與卷葉表型相關的基因PGY1, PGY2, PGY3, AE5, STV1 and SGS3，這幾個基因的蛋白表達水平在蛋白質組學結果是顯著下調。qRT-PCR驗證結果顯示，在Bndcl1株，這些基因mRNA表達水平顯著降低，表明這些基因在蛋白質和mRNA水平上發生了一致的變化（圖6A）。另外作者從轉錄水平上檢測了葉極性的關鍵調節因子：AS1, AS2, KAN1, KAN2, REV, RDR6, AGO7, AGO1(圖6B)。結果發現在Bndcl1株，AS1, KAN2發生了顯著降低，AS2, KAN1沒有顯著變化，REV發生了顯著下調。此外，RDR6, AGO7, AGO1也同樣發生了顯著下調。最后作者還對油菜甾醇相關的6個差異蛋白進行了轉錄水平的驗證，結果與iTRAQ數據（圖6C）一致，說明了定量蛋白質組學分析所獲得的結果的可靠性。

圖6. qRT-PCR驗證分析            

文章小結
    這項結果研究表明，葉片近-遠軸極性和油菜甾醇代謝及信號通路的缺陷是導致Bndcl1突變株葉子向下卷曲表型的原因，葉片的適度卷曲能夠提高光吸收、能量轉移和CO2固定效率，進而提高了突變株的光合性能。此外，在突變株中，參與PSII修復周期的抗氧化劑和蛋白質水平的升高可能會減少非生物脅迫的光合損失。這項研究為油菜卷葉機制及卷葉對植物生理的影響提供了新的見解。因此，卷葉突變株因具有緊湊的結構，能提高光合效率和增強抗逆性，這也是作物育種理想株型。
 
解析文獻
Wenjing Chen, Shubei Wan, et al. Histological, Physiological, and Comparative Proteomic Analyses Provide Insights into Leaf Rolling in Brassica napus. 2018, DOI: 10.1021/acs.jproteome.7b00744
 
參考文獻
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