霍亂弧菌核酸檢測試劑盒（一管式PCR-熒光探針法）

◆ 產品說明

致病菌檢測系列可針對食品、飼料等樣品中的致病微生物的特異核酸片段進行擴增，儀器實時監測擴增過程中的熒光信號變化，自動判讀結果。本產品用于霍亂弧菌的檢測。檢出限為10³ CFU/ml。

◆ 產品組成（96測試）

◆ 適用儀器

   ABI 7500、CFX 96、Mx 3005P、LineGene9600等實時熒光PCR儀。

◆ 自備耗材和儀器

①冰盒；②移液器（0.5-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套滅菌吸頭；③離心機；④渦旋混勻器；⑤金屬浴；⑥均質機、攪拌機或研缽等研磨器具；⑦電子天平。

◆ 注意事項

1．本試劑檢測靈敏度高。為了防止污染，實驗要分區操作。

   1）第一區：樣本制備區。

 2）第二區：模板添加區。

   3）第三區：擴增及產物分析區。

   ★ 分區之間最好進行物理性隔離，避免人為因素造成的污染。

2．實驗過程中穿戴工作服和乳膠手套，不同區域獨立使用工具，需更換手套和實驗服。

3．嚴格按照操作步驟操作，試劑配制和加樣等步驟請嚴格按照說明書要求在冰盒上操作。

4．反應液中的成分對光敏感，應避光保存。試劑使用前要完全解凍，但應避免反復凍融，推薦使用前離心30秒，并按檢測頻次將反應液以適當體積分管保存。

5．反應結束后，擴增管請置于密封袋內丟棄，當日清理，開蓋易造成氣溶膠污染，禁止開蓋。

6．不同批號試劑請勿混合使用，在有效期內使用。

◆ 樣品處理

參照《SN/T 1022-2010 進出口食品中霍亂弧菌檢驗方法》中的7.1和7.2處理樣品，對樣品進行前增菌，制備的菌液保存待用。

以無菌操作取檢樣25 g，放入裝有225 mL滅菌APW增菌液的均質杯內，于8000rpm/min～10000rpm/min均質1 min～2 min，或以剪刀充分剪碎，制成1:10樣本勻液。深凍樣品、干品、鹽漬產品的初始增菌液放置在37℃ ± 1℃培養6 h ± 1 h，新鮮樣品的初始增菌液放置在41.5 ℃ ± 1 ℃培養6 h ± 1 h。如果樣品不夠25g，則取全部樣品，加入9xmL增菌液以獲得10-1濃度的樣品勻液。若上述制備的待檢樣品不能在當日進行培養，應放置在2℃~8℃保存至次日。為提高檢出率，可進行第二次增菌，取1 ml培養物接種到10 ml的APW中，置于41.5 ℃ ± 1 ℃培養18 h ± 1 h（加入樣品前，APW應預先保溫至37℃±1℃）。

詳細步驟請按照標準操作或查閱食安通軟件。

◆ 實驗操作

1. 模板制備（樣本制備區）

建議使用試劑配套細菌組DNA提取系列產品，具體過程詳見產品說明書。

2．添加模板（樣本制備區，放置于冰盒中進行）

剪下所需測試數的已含有反應液的PCR管，放置在室溫待解凍后，離心30秒后揭開封口膜，向每管反應液中分別加入5μL模板，順序為NG、待測樣品模板、PG-VC-P。蓋好配套的PCR管蓋后，渦旋混勻30s，離心1min，立即進行PCR擴增反應。

3. 擴增反應（擴增及產物分析區）

使用熒光定量PCR儀，熒光基團選擇FAM，淬滅基團選擇TAMRA。

按下列條件設置擴增反應：

4.基線和閾值設定

  基線調整取3-15個循環的熒光信號，閾值線應超過陰性對照擴增曲線的最高點。

◆ 結果判定

檢測樣品無Ct值或≥40.0，曲線為直線或輕微斜線，無“S”型擴增曲線，可報告樣品陰性，不含有霍亂弧菌或含量低于檢測限；

檢測樣品Ct≤35.0，曲線呈“S”型擴增曲線，可直接報告樣品陽性，含有霍亂弧菌；

檢測樣品35.0＜Ct＜40.0，需進行一次重復實驗，若Ct值≥40.0則為陰性，否則為陽性。

• NG反應為平滑直線，PG反應為“S”型擴增曲線且Ct值＜30，此次檢測結果有效，否則無效。如重復檢測結果仍為無效，請與技術支持人員聯系。
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