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還原型谷胱甘肽(reduced glutathione, GSH)試劑盒說明

瀏覽次數:4588 發布日期:2018-5-9  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負

還原型谷胱甘肽reduced glutathione, GSH試劑盒說明書

分光光度法 50 /48

注意:正式測定之前選擇 2-3 個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義:

GSH 是細胞內最主要的抗氧化巰基物質,在抗氧化、蛋白質巰基保護和氨基酸跨膜運輸等中具有重要作用。還原型與氧化型比值(GSH/GSSG)是細胞氧化還原狀態的主要動態指標。因此,測定細胞內 GSH 和 GSSG 含量以及 GSH/GSSG 比值,能夠很好地反映細胞所處的氧化還原狀態。

測定原理:

DTNB 與 GSH 反應生成復合物,在 412nm 處有特征吸收峰;其吸光度與 GSH 含量成正比。

自備儀器和用品:

可見分光光度計、低溫離心機、水浴鍋、可調節移液器、1mL 玻璃比色皿和蒸餾水。

試劑組成和配制:

試劑一:液體×1 瓶,4℃保存。

試劑二:液體×1 瓶,4℃保存。

試劑三:液體×1 瓶,4℃避光保存。

粗酶液提取:

1. 組織:按照組織質量(g):試劑一體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議稱取約 0.1g 組織,加入 1mL 試劑一)進行冰浴勻漿。8000g,4℃離心 10min,取上清置冰上待測。

2. 細菌、真菌:按照細胞數量(104 個):試劑一體積(mL)為 500~1000:1 的比例(建議 500 萬細胞加入 1mL 試劑一),冰浴超聲波破碎細胞(功率 300w,超聲 3 秒,間隔 7秒,總時間 3min);然后 8000g,4℃,離心 10min,取上清置于冰上待測。

3. 血清等液體:直接測定。

GSH 測定操作:

1. 分光光度計預熱 30min,調節波長到 412 nm,蒸餾水調零。

2. 試劑二置于 25℃(一般物種)或者 37℃(哺乳動物)水浴中保溫 30min。

3. 空白管:取 1mL 玻璃比色皿,依次加入 100μL 蒸餾水,700μL 試劑二,200μL 試劑三, 混勻靜置 2min 后測定 412 nm 吸光度 A1。

4. 測定管:取 1mL 玻璃比色皿,依次加入 100μL 上清液,700μL 試劑二,200μL 試劑三, 混勻靜置 2min 后測定 412 nm 吸光度 A2。

注意:空白管只需要測定一次。

GSH 含量計算公式:

GSH 標準曲線公式:y=1.5 x(x 為 GSH 濃度,μ mol /mL;y 為吸光值)

GSH 計算:

(1) 按蛋白濃度計算

GSH(μ mol/ mg prot)=(A2-A1) ÷1.5×V 樣÷(V 樣×Cpr )=0.667×(A2-A1) ÷Cpr

(2) 按樣本鮮重計算

GSH(μ mol/g 鮮重)=(A2-A1) ÷1.5×V 樣÷(V 樣÷V 樣總×W)=0.667×(A2-A1) ÷W

(3) 按細胞數量計算

GSH(μ mol /104 cell)=(A2-A1) ÷1.5×V 樣÷(V 樣÷V 樣總×細胞數量)=0.667×(A2-A1) ÷細胞數量(4) 按液體體積計算

GSH(μ mol/ mL)=(A2-A1) ÷1.5×V 樣÷V 樣 =0.667×(A2-A1)

V 樣總:上清液總體積,1 mL;V 樣:加入反應體系中上清液體積,100μL=0.1 mL;W: 樣品質量,g ;Cpr:上清液蛋白質濃度,mg/mL;

注意事項:

1. 試劑一中含有蛋白質沉淀劑,因此上清液不能用于蛋白濃度測定。

2. 最低檢出限為 0.01mmol/L。

發布者:上海一基實業有限公司
聯系電話:021-60536261
E-mail:2851717098@qq.com

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