胚胎基因編輯解析：借助電轉方法將Cas9蛋白質/sgRNA導入小鼠原核受精卵生成非嵌合體突變體

基因編輯技術指能夠讓人類對目標基因進行“編輯”，實現對特定DNA片段的敲除、加入等。而CRISPR/Cas9技術自問世以來，就有著其它基因編輯技術無可比擬的優勢，技術不斷改進后，更被認為能夠在活細胞中最有效、最便捷地“編輯”任何基因。

應用方向

1. 基因敲除：如果想使某個基因的功能喪失，可以在這個基因上產生DSB，非同源末端連接（NHEJ）修復的過程中往往會產生DNA的插入或刪除（indel），造成移碼突變，從而實現基因敲除。
2. 特異突變引入：如果想把某個特異的突變引入到基因組上，需要通過同源重組來實現，這時候要提供一個含有特異突變同源模版。正常情況下同源重組效率非常低，而在這個位點產生DSB會極大的提高重組效率，從而實現特異突變的引入。
3. 定點轉基因：與特異突變引入的原理一樣，在同源模版中間加入一個轉基因，這個轉基因在DSB修復過程中會被拷貝到基因組中，從而實現定點轉基因。通過定點轉基因的方法可以把基因插入到人的基因組AAVS1位點，這個位點是一個開放位點，支持轉基因長期穩定的表達，破壞這個位點對細胞沒有不良影響，因此被廣泛利用。

下面這篇文章就是針對第三個應用方向的成功闡述。 

借助電轉方法將Cas9蛋白質/sgRNA導入小鼠原核受精卵生成非嵌合體突變體

摘要

CRISPR/Cas9系統被廣泛應用于各種有機體，特別是小鼠，用來闡明基因的作用。為了獲得優化的小鼠胚胎，Cas9 mRNA和sgRNA通常通過注射或是電轉導入受精卵。然而，由此種方法生成的大多數突變體都是嵌合體，包含不同類型的突變體，導致復雜的表型分析。為了使基因功能分析更加簡化，急迫的需要尋找一種生成非嵌合體突變體的方法。這里，我們確定了一種方法，可以生成非嵌合體小鼠突變體胚胎。我們通過電轉化同時導入Cas9蛋白質和sgRNA 入離體小鼠受精卵。確保基因編輯發生在小鼠基因組的第一次復制之前。結果，所有細胞都攜帶相似的突變體表現型。這個方法解決了利用CRISPR/Cas9系統產生的嵌合體突變體的問題。

材料與方法

電轉化

CUY21 EDIT II和LF501PT1-10 鉑金盤電極（長：10mm，寬：3mm，高：0.5mm，gap：1mm）(BEX Co. Ltd., Tokyo, Japan)用于電轉化。

電極連接在電轉化儀上，另一端連接在體式顯微鏡下。30-40個來自于交配受孕或體外受孕的受精卵同時進行電轉染。受精卵培養在KSOM培養基內，用Opti-MEM I 清洗三遍，去掉血清，在電極的槽內縱向排列成一條直線，并添加5uL Opti-MEM I，并加入Cas9蛋白質和sgRNA或mcherry mRNA。電轉條件是30V （3ms 脈沖時長+97ms間隔）7個cycle。電轉后，受精卵立即從電擊槽中取出，分別用M2培養基洗4次、KSOM培養基洗2次。隨后受精卵培養在37℃,5%CO2培養箱內，直至出現二細胞階段。

結果

圖 通過電轉化Cas9蛋白質和sgRNA生成Fgf10突變體胚胎。（a）Fgf10基因和sgRNA靶序列。（b）電轉化發生的時間。電轉發生在體外受孕后5h。交配受孕受精卵電轉發生在E0.5。（c）代表胚胎展示了不同的肢體表現型：T1（沒四肢）T2（肢體缺陷，無前肢或無后肢）。Control受到電擊，但是沒有轉入Cas9蛋白和RNA。

總結

我們闡述了這種方法，將Cas9蛋白質和sgRNA轉入體外受精的卵細胞中，生成突變體。在DNA第一次復制前，通過NHEJ-介導的缺失插入或是HDR-介導的基因插入，生成嵌合度較低的突變小鼠。我們的電轉方法對構建轉基因模式小鼠非常有效。

文章出處

Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse. Developmental Biology. 2016