銳博生物：環狀RNA研究的方法及功能作用介紹
銳博生物：環狀RNA—隱秘的未知RNA平行宇宙
環狀RNA，被喻是隱秘的未知RNA平行宇宙。最近，復旦大學的鄭秋鵬博士（2016交流會嘉賓之一）以第一作者身份在Nature Communications上發布了他們關于circHIPK3的最新研究成果。現在就和小編一起來學習circRNA的研究思路，認識圓圈重塑的RNA世界吧。
環狀RNA測序的樣本選擇、分析方法
RNA測序分析來自6個正常組織（腦、結腸、心臟、肝、肺、胃）和7個癌癥組織（膀胱尿路上皮癌、乳癌、結直腸癌、肝癌、胃癌、腎透明細胞癌、前列腺癌）的去核糖體RNA后的總RNA，發現了67,358個潛在的環狀RNA，其中27,296含有至少兩個unique back-spliced reads。
研究者使用RefSeq database 24對這些環狀RNA進行注釋；環狀RNA表達差異使用Wilcoxon rank-sum test計算，比較癌癥樣本與相應正常組織樣本。
初步鑒定預測的新環狀RNA
為排除它們是線性的反式剪接產物，研究者檢測了它們的物理特性。針對36個共同表達的待鑒定環狀RNA轉錄本，設計了Outward-facing引物。每對引物分別擴增一個來自HEK-293T cDNA的不同產物。在RNase R處理后，全部36個back-spliced序列都明顯存在。
選擇哪個環狀RNA繼續下游功能研究呢？
通過錨點比對 (Anchor alignment)，根據它們的線性形式，給測序數據中每一個環狀RNA進行豐度定量。研究者檢測了它們的5’端和3’端成環比 (circular ratio，CR)，以5’ CR>0.2; 3’ CR>0.2; SRPBM>1為標準時，得到了990個高豐度表達的環狀RNA。研究者留意到，這里面的其中一個環狀RNA來自于HIPK3基因Exon2，命名為circHIPK3，豐度與back-spliced（反向剪接）比都很高。
多維尺度法篩選高豐度circRNA。紅點和黑點分別表示高豐度和低豐度circRNA，circHIPK3以藍點顯示。灰色部分為篩選得的高豐度circRNA。
環狀RNA研究第一步：鑒定環狀
研究者使用outward-facing引物擴增出了預期大小的不同產物，并通過sanger測序確定了序列。環狀的表達水平通過qRT-PCR檢測，結果與RNA-seq一致，在多種組織里的表達量均高于其線性形式。
然后研究者檢測了它在HeLa細胞中的穩定性和定位情況，用Actinomycin D（轉錄抑制劑）處理細胞后，環狀RNA仍具有高穩定性，并能抵抗RNase R外切酶消化，表明它確實為環狀形式。
e) qRT-PCR顯示了circHIPK3和HIPK3 mRNA在HeLa細胞質或核。f) circHIPK3的RNA FISH實驗。
circHIPK3是如何形成的？
HIPK3 Exon2兩側的外顯子分析顯示，高度互補Alu重復序列與28個短散在重復序列 (SINE) 處在HIPK3 Exon2上游的內含子中，51個SINE處于Exon3下游。研究者使用CRISPR/Cas9技術，去除了HEK-293T細胞中的circHIPK3側翼Alu序列，結果發現下游Alu序列刪除后，環化被抑制，但上游Alu刪除后不僅沒有減少circHIPK3的生成，還稍微增加了。
示意圖顯示基因組上HIPK Exon2區域含有側翼Alu重復序列和長內含子。Alu元件和長內含子使用CRISPR/Cas9系統進行刪除(gRNA1-6)。在gRNA兩側的引物用于檢測刪除效果(P1-5)
引物環狀外顯子的上游有許多Alu元件，研究者猜測內含子中有其他Alu元件可能促進環化，于是刪除了上游大的內含子 (gRNA5、gRNA6)，結果circHIPK3顯著下調，而HIPK3 mRNA沒有變化，證明刪除只影響back spilcing，而不影響典型的剪接，表明帶Alu互補重復序列的側翼長內含子，是circHIPK3生成所必需的。
使用4對gRNA把序列刪除(gRNA3-6)，進行普通PCR和qRT-PCR，引物位點設計在刪除區域外(P4+P5)
銳博小編說
RNA是怎樣變成環狀的呢？
a. 在可變剪切過程中，外顯子遷移，剪切形成套索結構，拉近剪切位點，促進序列成環
b. 依賴鄰近的反向互補序列配對，拉近剪切位點，使其相互攻擊，促進序列成環
c. 單個內含子直接成環
d. RNA結合蛋白、反式作用因子參與成環
研究功能，敲降看看
據文獻報道，環狀RNA可以被小干擾RNA敲降7。如下圖所示，研究者使用了三種siRNA：一種靶向backsplice序列 (si-circHIPK3)，一種靶向線性轉錄本 (si-HIPK3)，一種靶向線性和環狀共有的環狀外顯子 (si-both)，均由銳博生物提供。接著，研究者通過細胞增殖實驗及EdU染色（銳博生物提供）觀察敲降后的情況，發現si-circHIPK3能抑制幾種不同的細胞生長，而si-HIPK3不能。
通過EdU試驗，檢測轉染3種siRNA 48h后Huh-7細胞的DNA合成情況。
circHIPK3充當miRNA海綿
來自doRiNA的AGO2 CLIP-Seq公開數據顯示AGO2位于circHIPK3區域。研究者進行了pull down、熒光素酶報告基因實驗，證明了circHIPK3可能是AGO2和miRNA結合的中間媒體。
為了尋找與circHIPK3結合的miRNA，研究者使用熒光素酶篩選miRNA文庫。在424個miRNA中，有9條miRNA能夠顯著減弱熒光素酶報告基因活性。使用TargetScan和PicTarmiRNA預測軟件，發現它們含有circHIPK3區結合位點。于是研究者把這些結合位點突變了，轉染突變后的miRNA，并不能減少報告基因活性。此項結果表明circHIPK3可能是這些miRNA的海綿 (sponge)。
HEK-293T細胞轉染424個miRNA mimic，進行熒光素酶報告基因實驗篩選，鑒定它們是否能夠與circHIPK3結合。圖中標注的9個miRNA對酶活抑制較明顯。
值得注意的是，這9種miRNA都能抑制細胞生長，其中miR-124效果最顯著，于是研究者使用生物素偶聯的miR-124 mimic（銳博生物提供），富集了大量circHIPK3。多個實驗的結果綜合表明，circHIPK3能夠直接結合到miR-124，抑制其活性。
左圖：HEK-293T細胞轉染3‘偶聯鏈霉親和素的miR-124后，捕獲得的細胞裂解液中circHIPK3水平；右圖：轉染si-cHIPK3、miR-124或cHIPK3載體到HEK-293T細胞，qRT-PCR檢測IL6R和DLX2表達情況。IL6R和DLX2是miR-124的兩個已知的增殖促進靶標，會隨著circHIPK3的敲降而下調，表明circHIPK3可以挽救miR-124對它們的抑制。
銳博小編說
環狀RNA有什么功能和作用？
1. 調控親本基因表達
僅有內含子的ciRNA與pol II結合促進基因轉錄
有內含子+外顯子的ElciRNA與U1 snRNP形成復合體，再與pol II結合，促進基因轉錄
2. 充當ceRNA
僅有外顯子的circRNA有MRE，吸附miRNA，調控miRNA表達（miRNA海綿）
3. 作為疾病的biomarker
4. 成為新的疾病治療靶點
原文：Zheng Q, et al. Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs. Nat Commun. 2016 Apr 6;7:11215.
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