LC-MS/MS與柱前衍生法用于腦脊液和腦微透析液中神經遞質類物質的代謝靶標分析

瀏覽次數：4181　發布日期：2017-2-16　來源：本站　僅供參考，謝絕轉載，否則責任自負

關鍵詞
TSQ Quantum Access MAX LC-MS/MS；代謝靶標分析；神經遞質；腦脊液

1. 前言
在廣義的代謝組學（Metabolomics）研究中，代謝靶標分析是一種常見的研究策略，它以處于特定代謝通路上具有相似/相近生物功能的一系列小分子物質群為研究標的，通過對其絕對或相對定量，進而對實驗涉及的生物學問題進行驗證。芳香族氨基酸代謝產生的單胺神經遞質多巴胺（Dopamine）、去甲腎上腺素（Norepinephrine）、 5-羥色胺（5-HT）及其代謝終產物高香草酸（HVA）、 3,4-二羥基苯乙酸（DOPAC）、 5-羥基吲哚乙酸（5-HIAA），以及谷氨酸（Glutamate）及其脫羧生成的抑制遞質γ-氨基丁酸（GABA），連同乙酰膽堿（Acetylcholine）、抗壞血酸（Ascorbic acid）等小分子物質都是神經藥理學領域中尤為關注的分析對象。高靈敏、高特異與快速地離體或在體定量測定腦脊液與腦微透析液中這類代謝物的準確含量，對于神經生物學研究意義重大。采用經典的電化學方法，囿于這類物質的酸堿性差異懸殊、基質干擾復雜等不利條件，常在方法特異性與分析通量上受到限制。而直接使用 HPLC-MS/MS 方法時，又面臨色譜保留弱（反相分離RP）、基質干擾大、樣品中緩沖鹽濃度大、 ESI 電離效率低下（RP&親水作用色譜 HILIC）等種種挑戰。

利用 Thermo ScientificTM TSQ Quantum Access MAXTM LCMS/MS，本文報道了一種測定上述神經遞質與相關代謝物含量的代謝靶標分析方法。采用苯甲酰化柱前衍生，本方法可有效提高強極性目標分析物的疏水性，并顯著改善其 ESI 電離效率，從而有效克服復雜基質干擾，提高檢測靈敏度，適用于神經生物學、臨床樣本檢測、神經藥效學評價等研究。

2. 實驗部分
2.1 生物樣品準備與衍生化：
小鼠腦脊液與腦微透析液樣本由沈陽藥科大學藥理學教研室采集并提供，腦脊液使用乙腈脫蛋白，微透析液直接使用。衍生方法參考文獻進行[1,2]，簡述為：取適量樣品置于尖頭管中，按照1/2樣品體積的比例，依次加入催化劑 100 mM 四氫硼酸鹽緩沖液與衍生化試劑 5% 苯甲酰氯-乙腈溶液（V/V），渦旋混勻后室溫下反應，離心取上清，供 HPLC-MS/MS 分析。抗壞血酸與乙酰膽堿，以及其余 8 種單胺神經遞質與其代謝物的化學結構與衍生位點、反應途徑見圖1。

2.2 標準溶液配置：
取所有分析物混標母液，使用人工腦脊液逐級稀釋至一定濃度后，按 2.1 項下描述進行苯甲酰化衍生。所得樣品 HPLC-MS/MS 分析，外標法定量。

2.3 HPLC-MS/MS方法：
使用 Thermo Scientific AccelaTM 600 HPLC 進行分離， Thermo Scientific TSQ Quantum Access MAX 串聯三重四極桿質譜檢測方法使用 EZ Method 模式編輯，定時選擇反應監測 timed SRM 主要參數見表 1，其余分析條件見表 2、 3。

2.4 數據處理:
采用 Thermo Scientific TraceFinderTM 軟件（version 3.2）進行數據處理。

3. 結果與討論
柱前衍生反應中目標代謝物均有 1~3 個酚羥基或胺基位點與苯甲酰基結合（乙酰膽堿與抗壞血酸除外），這所帶來的疏水性增加與 ESI電離活性改善，使得本方法相較于未衍生直接分析方法的特異性與靈敏度顯著提高。圖 2 為實驗條件下各個代謝物的色譜圖，均峰形對稱良好。圖 3 為多巴胺與高香草酸衍生產物的 MS/MS 譜圖及其裂解規律，苯甲酰衍生產物 MS/MS 斷裂時會產生極其優勢的 m/z 105.1C7H5O+ 碎片，這也非常有助于保證檢測方法靈敏度提高的顯著性。

圖 4為利用 TraceFiner軟件對本實驗代謝靶標定量數據處理后的結果界面， TraceFinder高度集成的信息展示與并行處理能力，尤適合于大樣本代謝靶標分析中的高通量數據處理。本實驗采用的柱前衍生方法操作簡便，反應迅速充分。方法學考察表明，代謝靶標分析方法的線性、重現性與穩定性良好，利用 TSQ Quantam Access MAX 質譜能獲得遠低于 ng/mL（ppb）級的檢測靈敏度，完全能夠滿足這類神經活性物質生理濃度測定的技術要求。表 4 為利用本文方法對神經藥理學實驗中正常小鼠腦脊液實際樣品進行測定的部分結果。