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雙壓線性離子阱質譜用于單克隆抗體分子量測定

瀏覽次數:2770 發布日期:2017-2-9  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負
張曉夕
賽默飛世爾科技(中國)有限公司
 
前言
目前,在對包括癌癥在內的各種疾病的診斷和治療中,單克隆抗體(mAbs)起到了越來越重要的作用,其相關研究發展也十分迅速。不同于傳統的小分子藥物,單克隆抗體的結構十分復雜,存在多種異構現象,故單克隆抗體結構表征就顯得尤為重要。由于生物質譜所具有的“軟電離”模式和高靈敏度、高質量精度和寬動態范圍等優點,在單克隆抗體分子量測定、蛋白序列測定、翻譯后修飾分析及雜質分析等方面,質譜正在起到越來越重要的作用。
 
離子阱質譜經常被用于未知物的結構解析,以及常規的蛋白序列測定、翻譯后修飾和糖鏈結構解析等。已有實驗結果表明,使用LTQ Velos 離子阱質譜可以對小的完整蛋白(16kDa)進行top down 解析[1];然而,使用離子阱質譜對150kDa 的完整單克隆抗體進行完整分子量測定尚未見報道。
 
 
在本文的研究中我們使用Velos Pro 雙壓線性離子阱質譜,對完整單克隆抗體及其輕重鏈分別進行了分子量測定。實驗結果表明,離子阱質譜也能對150kDa 的完整單克隆抗體進行分子量測定,且不同糖型可得到分辨。
 
實驗部分
樣品信息
本次實驗使用完整單克隆抗體樣品,樣品濃度2μg/μL;取部分樣品上樣至常規液相色譜,經在線脫鹽后質譜測定其分子量;另取部分完整單克隆抗體樣品經二硫蘇糖醇(DTT)對二硫鍵還原烷基化后上樣至LC-MS 系統,分別測定輕、重鏈分子量。
 
常規液相色譜方法
色譜儀:Thermo Scientific Accela 600
色譜柱:Thermo BioBasic 8 HPLC(5μm, 2.1mm, 100mm)
上樣量:4μL(8μg)
流動相:A: 0.1% 甲酸水溶液,B: 0.1% 甲酸乙腈溶液梯度如下,其中前四分鐘為在線除鹽過程:
 
質譜方法
質譜儀:Velos Pro 線性離子阱質譜儀
噴霧電壓:3.8 kV
毛細管溫度:275 ℃
S-lens:66.8%
Scan Rate:Normal
m/z range:800-3500
In source CID:75eV
AGC target:3e5
 
數據分析
數據使用ProMass 軟件進行去卷積分析。
 
結果與討論
Velos Pro 線性離子阱質譜用于完整單克隆抗體分子量測定
 
 
圖1. LTQ Velos Pro 測定完整單克隆抗體分子量原始譜圖
 
 
圖2. 對圖1 譜圖進行去卷積
 
由圖1 及圖2 可以看出:首先,使用Velos pro 雙壓線性離子阱質譜對完整單克隆抗體(150kD)進行分子量測定,得到的譜圖中可見不同電荷態的峰均勻分布(圖1);對其使用ProMass 軟件進行去卷積分析,可知所測單克隆抗體分子量為147491Da,且不同糖型得到分辨(圖2)。
 
Velos Pro 線性離子阱質譜用于單克隆抗體輕/ 重鏈分子量測定
使用DTT 對完整單克隆抗體進行還原處理后,分別對抗體的輕、重鏈進行分子量測定,結果如下:
 
 
圖3. LTQ Velos Pro 測定單克隆抗體輕鏈分子量
 
 
圖4. LTQ Velos Pro 測定單克隆抗體重鏈分子量
 
由圖3 及圖4 可以看出,對于DTT 處理后的單克隆抗體,分別測定其輕、重鏈分子量,同樣可得不同電荷態的峰均勻分布的譜圖;經去卷積后,分別可以得到輕、重鏈的分子量。其中重鏈部分的雜峰較多(圖4),可能為不同糖型及單抗發生降解所導致。
 
結論
在本文的研究中,我們使用Velos Pro 雙壓線性離子阱對完整單克隆抗體及其輕重鏈進行了分子量測定。結果表明:首先,對于完整單克隆抗體,離子阱質譜可以實現分子量測定并分辨出不同糖型;對于經DTT 還原后的輕、重鏈,離子阱質譜同樣可以測定其分子量和不同糖型。離子阱質譜可滿足傳統定性分析需求,是未知化合物結構解析的強大武器;在蛋白質藥物研究方面,被廣泛用于肽圖分析、序列鑒定和翻譯后修飾研究等。通過本文的研究,我們證明了離子阱質譜同樣可以用于單克隆抗體分子量的測定。
 
同時,由于離子阱質譜可對化合物進行多級質譜解析,在肽段的翻譯后修飾研究、尤其是糖鏈的精細結構解析中起到不可或缺的作用。另外,雙壓線性離子阱Velos Pro同時具有高壓和低壓阱,高壓阱提供最大化離子捕獲、裂解和隔離效率,低壓阱提供其他離子阱質譜所無法比擬的分辨率和掃描速率。綜上,離子阱質譜亦為生物制藥行業相關分析的有力工具。
 
參考文獻
[1] Tonya Pekar Second, Joshua J. Coon, Vlad Zabrouskov. A Novel Dual-Pressure Linear Ion Trap Mass Spectrometer Improves the Analysis of Complex Protein Mixtures[J]. Anal Chem. 2009 September 15; 81(18): 7757–7765.
發布者:賽默飛世爾科技(色譜與質譜)
聯系電話:13386161207
E-mail:ping.shen2@thermofisher.com

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