一箭N雕，lncRNAi實(shí)現(xiàn)腫瘤精準(zhǔn)治療

由于引起腫瘤的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，因此，是否可以通過(guò)一次靶向多個(gè)OncomiR進(jìn)行腫瘤治療呢？今天，小編通過(guò)一篇發(fā)表在《Molecular Cancer Therapeutics》上的研究，來(lái)看看科學(xué)家們?cè)趺词褂胠ncRNAi的方法，通過(guò)靶向多個(gè)OncomiRs來(lái)實(shí)現(xiàn)HCC的精準(zhǔn)治療。

研究背景

腫瘤的精準(zhǔn)醫(yī)療是現(xiàn)在大家關(guān)注的熱點(diǎn)，針對(duì)小分子的腫瘤靶向治療是熱點(diǎn)中的熱點(diǎn)。已有研究表明，在腫瘤發(fā)生，增殖，轉(zhuǎn)移過(guò)程中，存在著大量的異常表達(dá)miRNA，稱之為“OncomiR”。而這些OncomiRs通過(guò)靶向下游mRNA，調(diào)控了功能基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。針對(duì)腫瘤細(xì)胞中過(guò)量表達(dá)的miRNA，通過(guò)miRNA抑制劑或者antisense 序列來(lái)人為降低miRNA的表達(dá)，是可以抑制腫瘤生長(zhǎng)的，已有的研究也是從這個(gè)方向多發(fā)，抑制某一個(gè)miRNA的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)腫瘤治療。但是，這種方法的局限性在于，由于一個(gè)miRNA可以調(diào)控多個(gè)mRNA，而一個(gè)mRNA又受到不同的miRNA的調(diào)控，如果只干預(yù)了一個(gè)miRNA的表達(dá)，通常情況下是很難實(shí)現(xiàn)對(duì)整個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)而導(dǎo)致治療效果不佳。針對(duì)這樣一個(gè)生物學(xué)問(wèn)題，本研究通過(guò)lncRNAi的方式，人為合成一條長(zhǎng)鏈非編碼RNA，通過(guò)同時(shí)靶向多個(gè)不同的miRNA分子，來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)HCC的精確治療。這個(gè)方法是否可行呢？讓我們一起往下看。

研究結(jié)果

1、HCC細(xì)胞lncRNAi模型建立與確認(rèn)
為了同時(shí)干預(yù)多個(gè)OncomiRs，研究人員腺病毒載體構(gòu)建了同時(shí)能靶向12個(gè)miRNA(miR21,miR221/222,miR224,miR17-5p/20a,miR10b,miR106b,miR151-5p,miR155,miR181a/181b,miR184,miR1和miR501-5p)，AdSVPE1a-lncR。結(jié)果顯示，在HepG2,Hep3B,MHCC97H，Huh-7和PLC/PRF /5細(xì)胞系中都能表達(dá)，而在正常肝細(xì)胞系WRL-68和L02中不能表達(dá)。HepG2, Hep3B,MHCC97H, Huh-7, PLC/PRF/5 SMMC-7721, MHCC97L細(xì)胞中能檢測(cè)到高的E1a表達(dá)，而在BEL-7402, WRL-68, L02細(xì)胞中表達(dá)很弱。在SMMC-7721和MHCC97L細(xì)胞中，AdSVPE1a-lncR的復(fù)制水平有成百倍，而在正常細(xì)胞系L02和WRL-68中復(fù)制水平很低。因此，研究人員成功的將lncRNAi體系在HCC細(xì)胞系中實(shí)現(xiàn)了表達(dá)。

2、lncRNAi下游靶基因影響鑒定

qRT-PCR檢測(cè)顯示，AdSVPE1a-lncR–mediated lncRNAi表達(dá)水平在Huh-7,Hep3B和HepG2細(xì)胞中比較高，在PLC/PRF/5, MHCC97H, BEL-7402,MHCC97L, and SMMC-7721相對(duì)比較低，而在WRL-68和L02細(xì)胞中很低。那么，lncRNAi是否可以影響下游miRNA及靶基因表達(dá)呢？結(jié)果顯示，miR21和miR17-5p在HepG2細(xì)胞中顯著抑制，相應(yīng)的靶基因PTEN有明顯上調(diào)。進(jìn)一步的熒光素酶檢測(cè)也表明pGL3-miR21/17-5p在HepG2相比L02細(xì)胞表達(dá)明顯低。因此，lncRNAi可以抑制OncomiRs來(lái)保護(hù)下游靶基因。

3、lncRNAi影響HCC細(xì)胞的增殖和遷移能力

lncRNAi在細(xì)胞中能起作用，那么會(huì)影響哪些細(xì)胞的生物學(xué)功能呢？結(jié)果顯示，AdSVPE1a-lncR有非常顯著的Hep3B和Huh-7細(xì)胞殺傷能力。在Hep3B細(xì)胞中加入MOI=0.5 pfu/cell ，細(xì)胞存活不到50%，加入MOI=2 pfu/cell，細(xì)胞存活不到10%。在其他細(xì)胞系，HepG2,MHCC97L,PLC/PRF/5,MHCC97H和SMMC-7721細(xì)胞在加入MOI=100 pfu/cell時(shí)，存活也少于50%。但是，對(duì)BEL-7402細(xì)胞的細(xì)胞殺傷卻不顯著，對(duì)正常肝細(xì)胞系沒(méi)有顯著殺傷力。因此，lncRNAi只有對(duì)腫瘤細(xì)胞具有殺傷力，影響其增殖能力。細(xì)胞遷移和侵襲能力檢測(cè)也表明，AdSVPE1a-lncR能顯著抑制HepG2, MHCC97H, PLC/PRF/5, Hep3B, Huh-7細(xì)胞的遷移和侵襲能力，而在BEL-7402, SMMC-7721, MHCC97L細(xì)胞中的抑制能力相對(duì)較弱。因此，lncRNAi顯著抑制了腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

當(dāng)HCC細(xì)胞感染AdSVPE1a-lncR后，PLC/PRF/5, Hep3B, Huh-7細(xì)胞滯留在G0-G1階段。PLC/PRF/5 ,Hep3B細(xì)胞滯留在G2-M階段。HepG2和 MHCC97H細(xì)胞滯留在S階段。但是，BEL-7402, SMMC-7721, MHCC97L的細(xì)胞周期影響較弱。

另外，在這些感染細(xì)胞中，所有細(xì)胞系的細(xì)胞凋亡比率顯著增加，而BEL-7402，WRL-68和L02細(xì)胞的凋亡比率不顯著。因此，lncRNAi只會(huì)影響HCC細(xì)胞的凋亡過(guò)程。

4、 lncRNAi作用分子機(jī)制探究

既然HCC細(xì)胞的生物學(xué)功能發(fā)生了變化，那么，其內(nèi)在的分子機(jī)制是什么呢？通過(guò)對(duì)AdSVPE1a-lncR ，AdSVPeGFP-lncR（對(duì)照）感染細(xì)胞系全基因組表達(dá)譜篩選（由上海伯豪提供），發(fā)現(xiàn)AdSVPE1a-lncR感染的4個(gè)不同細(xì)胞系有2091個(gè)差異基因，而AdSVPeGFP-lncR只有101個(gè)差異。其中，271個(gè)共有上調(diào)和176個(gè)共有下調(diào)基因中，上調(diào)基因主要是凋亡誘導(dǎo)基因和增殖抑制基因。Western blot實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證PTEN和p27kip1顯著增加。

AdSVPE1a-lncR感染后mRNA發(fā)生變化，miRNA是否也有變化呢？通過(guò)全基因組miRNA表達(dá)譜芯片檢測(cè)，研究人員發(fā)現(xiàn)HCC細(xì)胞中有大量的miRNA表達(dá)發(fā)生改變。

qRT-PCR顯示，只有miR21在所有的HCC細(xì)胞中都表達(dá)下調(diào)。

5、lncRNAi作用效果體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明lncRNAi確實(shí)對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生效果，芯片檢測(cè)也表明改變的基因和miRNA也確實(shí)和增殖凋亡相關(guān)。那么，這樣的效果在體內(nèi)是否也一致呢？將AdSVPE1a-lncR治療后的Huh7和HepG2細(xì)胞移植裸鼠，21天后，治療組腫瘤體積減小。同時(shí)，Huh-7細(xì)胞移植模型的腫瘤質(zhì)量在治療后也明顯低于對(duì)照。

進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)和免疫組化檢測(cè)也表明miRNA靶基因PTEN和p27kip1表達(dá)顯著增加，而CDK4，p38/MAPK，Survivin表達(dá)顯著降低。

為了更進(jìn)一步的確認(rèn)體內(nèi)作用效果，研究人員用病人樣本的PDX小鼠模型進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，治療28天后，腫瘤質(zhì)量顯著減少。治療后，miRNA的靶基因PTEN表達(dá)顯著增加，Survivin表達(dá)顯著降低。因此，基于AdSVPE1a-lncR的lncRNAiHCC腫瘤治療確實(shí)能夠起到作用效果，是一種潛在的HCC治療方法。

研究結(jié)論

該研究采用lncRNAi的方法，在HCC細(xì)胞中同時(shí)靶向多個(gè)高表達(dá)miRNA，從而通過(guò)保護(hù)下游靶基因?qū)崿F(xiàn)對(duì)腫瘤的治療，從細(xì)胞角度，基因?qū)哟魏腕w內(nèi)小鼠模型實(shí)驗(yàn)確實(shí)表明lncRNAi能夠用來(lái)治療HCC，該研究為腫瘤的精準(zhǔn)醫(yī)療提供了一種新的方法，值得大家學(xué)習(xí)參考。

原文出處：Li X, Su Y, Sun B, Ji W, Peng Z, Xu Y, Wu M, Su C.An Artificially Designed Interfering lncRNA Expressed by Oncolytic Adenovirus Competitively Consumes OncomiRs to Exert Antitumor Efficacy in Hepatocellular Carcinoma.Mol Cancer Ther. 2016 .