Western Blot又稱為蛋白質(zhì)印跡，是分子生物學、生物化學和免疫遺傳學中常用的基于抗體抗原之間特異免疫反應的一種定量或定性檢測蛋白的實驗方法。

基本原理：聚丙烯酰胺凝膠電泳將不同分子量的蛋白質(zhì)樣品分離，分離后的蛋白被轉(zhuǎn)移到固相支撐物（雜交膜）上，抗體特異性識別目標蛋白，通過酶促反應或者化學發(fā)光等方法將目標蛋白可視化，從而對蛋白進行定性或者定量研究。

抗體與抗原之間的特異性識別是Western Blot實驗中最為關(guān)鍵的一個步驟，選擇的抗體是否合適、抗體的質(zhì)量優(yōu)劣都關(guān)乎實驗的成敗。下面將從高品質(zhì)抗體的選擇、驗證數(shù)據(jù)對抗體的重要性及內(nèi)參抗體的選擇標準等方面給大家一些建議。

√ 質(zhì)量是甄選優(yōu)質(zhì)抗體的首要標準

市面上常見的抗體有進口品牌、國產(chǎn)品牌、進口品牌國內(nèi)分裝這幾種類型。大部分進口品牌在抗體的質(zhì)量、特異性、效價及保存條件方面較有保障。而有些國產(chǎn)品牌的抗體，在做Western Blot時，由于其特異性不高，導致實驗結(jié)果出現(xiàn)背景不干凈，非特異性條帶多等問題。進口品牌國內(nèi)分裝則是個別經(jīng)銷商從廠家買到產(chǎn)品后，再通過稀釋、分裝、重新貼牌之后賣給客戶，這樣的抗體雖然價格相對便宜，但質(zhì)量良莠不齊，批間差異較大。

要確保抗體的高質(zhì)量，我們通常是選擇可信賴的品牌，此外，還應注意抗體的供應商渠道是否正規(guī)，其供應鏈物流是否專業(yè)。

√ 完善的驗證數(shù)據(jù)是抗體選擇的必要參考

優(yōu)質(zhì)抗體還應具備完善的驗證數(shù)據(jù)和詳細的信息標注，比如：是否明確標注其可以用于Western Blot、是否有足夠的數(shù)據(jù)支持證明該抗體適用于某一組織或者樣本、是否有明確的抗體建議稀釋濃度、該抗體的識別位點是連續(xù)的氨基酸序列的一級結(jié)構(gòu)還是非連續(xù)性氨基酸的三維結(jié)構(gòu)位點……這些信息和數(shù)據(jù)的真實性及完整性是保證Western Blot實驗順利進行的關(guān)鍵。

關(guān)于這一點，HPA金標抗體及其所提供的數(shù)據(jù)是一個很好的案例。HPA抗體數(shù)據(jù)庫覆蓋了人類85%的蛋白，每支抗體均通過嚴格的抗原序列篩選及親和層析純化流程，確保其特異性和純度。此外，每支抗體在多種組織樣品中經(jīng)過蛋白芯片、Western Blot、免疫組化、免疫熒光等實驗的驗證，并獲得學術(shù)委員會的認證。作為重要的參考數(shù)據(jù)，所有的實驗驗證、發(fā)表文獻和生物信息學預測都公布在proteinatlas.org網(wǎng)站供大家免費查詢。完善的實驗數(shù)據(jù)支持可避免因信息不完整而造成的選擇錯誤。

√ 有效的內(nèi)參抗體是實驗準確的重要憑證

在Western Blot中，內(nèi)參是由持家基因編碼表達的蛋白(Housekeeping Proteins)，在各組織和細胞中的表達相對恒定，在檢測蛋白的表達水平變化時常用來做參照物。借助內(nèi)參校正蛋白質(zhì)定量、上樣過程中存在的實驗誤差，是證明Western Blot實驗結(jié)果真實可靠的重要憑證。一些常見的內(nèi)參基因及抗體包括β-actin、GAPDH、PCNA、α-Tubulin等。

值得注意的是，不同的內(nèi)參抗體只適用于一定范圍的樣本和組織，我們需要查閱參考文獻，并根據(jù)樣本和組織的差別選擇合適的內(nèi)參抗體，以確保實驗的準確性。（如下表所示）

在Western Blot中如果抗體選擇或使用不當，可能會造成無信號、弱信號、高背景、有雜帶等實驗問題，下表就此類實驗問題給出案例分析和解決方案，供參考。

以上是關(guān)于Western Blot實驗過程中如何選擇合適的、高品質(zhì)抗體的一些建議，以及由于抗體選擇和使用不當而造成實驗失敗的問題總結(jié)，希望能給大家一些幫助和啟發(fā)。