【背景】

CIK 是「Cytokine-Induced Killer Cells」的縮寫，中文全稱為「細胞因子誘導的殺傷細胞」。 CIK 是單個核細胞在 CD3 單抗和多種細胞因子 （包括 IFN-γ, IL-2 等） 的作用下培養獲得的一群以 CD3+CD56+細胞為主要效應細胞的異質細胞群， 其既具有 T 淋巴細胞強大的抗腫瘤活 性，又具有 NK 細胞 （自然殺傷細胞） 的非 MHC （主要組織相容性抗原） 限制性腫瘤殺傷能力。 CIK 細胞具有殺瘤活性高、殺瘤譜廣，對正常組織毒性低，體外可高度擴增等特點，是目前 臨床上廣泛使用的過繼性免疫治療細胞。

DC 是「Dendritic  Cells」的縮寫，中文全稱為「樹突狀細胞」，因其成熟時伸出許多樹 突樣或偽足樣突起而得名。DC 是由 2011 年諾貝爾獎獲得者、加拿大籍科學家 Ralph M. Steinman 于 1973 年發現的，是目前發現的功能最強的抗原遞呈細胞 （Antigen Presenting Cells, APC）。已證實，DC 是唯一能夠顯著刺激初始 T 細胞 （Naïve  T cells） 增殖的 APC,而其它 APC （如單核巨噬細胞，B 細胞等） 僅能刺激已活化的或記憶性的 T 細胞。DC 是機體適應性 T 細胞免疫應答的始動者，在腫瘤免疫中具有極其重要的作用。

DC-CIK 即 DC 和 CIK 細胞在體外共培養，然后回輸給患者。嚴格的說，最終的效應細 胞是經 DC 體外活化的 CIK 細胞。多項研究表明，DC 與 CIK 具有協同作用，共同孵育后， DC 表面共刺激分子的表達及抗原遞呈能力均明顯提高，而 CIK 的增殖能力和體內外細胞毒 活性也得以增強，因此 DC-CIK 較單獨的 CIK 治療更為有效。若將腫瘤抗原負載的 DC 與 CIK 共培養，可刺激產生腫瘤抗原特異性的 T 細胞，這樣的 DC-CIK 治療則兼具特異性和非 特異性雙重腫瘤殺傷作用，比未負載腫瘤抗原的 DC 刺激活化的 CIK 活性更強，常被用于 臨床和科研。

【培養原理】

1.DC 培養用細胞因子：

GM-CSF （粒細胞巨噬細胞集落刺激因子）：

GM-CSF 是一種造血生長因子，在體外可刺激中性粒細胞和巨噬細胞的集落形成， 并具有促進早期紅巨核細胞、嗜酸性祖細胞增殖和發育的功能。GM-CSF 是最早被鑒定 出來對于 DC 有作用的細胞因子之一。

GM-CSF 在 DC 培養中的功能是促進單核細胞向大巨噬樣細胞分化，細胞表面 MHC II 類分子的表達得以提高，從而增強細胞的抗原遞呈功能。此外，GM-CSF 還可促進 DC 的存活。

IL-4 （白細胞介素-4）

IL-4 在由單核細胞誘導成 DC 的過程中發揮的作用是抑制巨噬細胞的過度生長，從 而引導單核細胞向 DC 方向分化。若培養體系中不加 IL-4,單核細胞將分化為巨噬細胞。

同時，IL-4 還有降低細胞表面表達 CD14 分子的能力。CD14 表達水平的降低是單核細 胞分化為 DC 的重要標志。

GM-CSF 和 IL-4 共同作用可使單核細胞定向分化為未成熟 DC  （immature  DC），此時的 DC 具有較強的抗原攝取和加工能力，但抗原遞呈能力很弱。細胞表面中度表達 MHC I 類、II 類分子和 B7 家族分子 （CD80, CD86 等），但不表達 CD14.

TNF-α （腫瘤壞死因子-α）

TNF-α可下調未成熟 DC 的巨胞飲作用和表面 Fc 受體的表達，使細胞內 MHC II 類 分子區室 （class II compartment） 消失，但能夠上調細胞表面 MHC I 類、II 類分子和 B7 家 族分子 （CD80, CD86 等） 的表達，使未成熟 DC 分化為成熟 DC（mature DC），此時 DC 的 抗原攝取和加工能力明顯減弱，而抗原遞呈能力顯著增強，可極強的激活 T 細胞。

2.CIK 培養用細胞因子和抗體：

CD3 激發型單抗：

T 細胞活化的第一信號來自于 T 細胞表面的受體，即 T 細胞抗原受體 （T cell antigen receptor,  TCR） 與 APC 提呈的抗原的特異性結合，也就是 T 細胞對抗原的特異性識別。 TCR 是由 2 條不同肽鏈構成的異二聚體，在 T 細胞表面，其與 CD3 分子通過非共價鍵 結合，形成 TCR/CD3 復合體。TCR 識別特異性抗原后會引起 CD3 和 T 細胞表面的輔助 受體 CD4 或 CD8 分子的胞漿尾部聚集，進而激活與胞漿尾部相連的酪氨酸激酶 （Lck, Fyn 和 ZAP-70 等），促使 CD3 分子胞漿區的免疫受體酪氨酸活化基序 （immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM） 中的酪氨酸 （Y） 磷酸化。磷酸化的酪氨酸 （pY） 進一步 磷酸化下游含酪氨酸的蛋白，從而引起激酶活化的級聯反應 （磷脂酰肌醇途徑或 MAP 激 酶途徑等），最終通過激活轉錄因子，使其進入細胞核內，結合于調控 T 細胞增殖和活化的靶基因 （如 IL-2 和 IFN-γ 等），引起基因的表達和轉錄，T 細胞因而由靜止狀態轉為 增殖和活化狀態。

由上可見，CD3 分子在 T 細胞活化信號的轉導中起著極其關鍵的作用。CD3 激發 型單抗與 T 細胞表面 CD3 分子特異性結合后，可引起 CD3 分子胞漿區 ITAM 基序中酪 氨酸的磷酸化，進而導致 T 細胞增殖和活化的下游信號的激活，從而使 T 細胞增殖和活 化。也就是說，CD3 激發型單抗能夠模擬抗原與 TCR/CD3 復合物的識別和激活過程， 從而引起 T 細胞的增殖與活化，因此是 CIK 細胞培養中不可或缺的刺激因素。

此外，CD3 激發型單抗在選用時一定要注意克隆號。研究表明，僅克隆號為 OKT-3 的 CD3 激發型單抗可以刺激所有人的 T 細胞的增殖，而其它克隆號的 CD3 激發型單抗 僅能刺激一部分人的 T 細胞。因此，在進行 CIK 培養時，最好選用 OKT-3 克隆，以保 證每個患者的 T 細胞均能被激活。

IL-2 （白細胞介素-2）

IL-2 最初發現時被稱為 T 細胞生長因子 （T cell growth factor, TCGF），是引起 T 細胞 增殖最重要的細胞因子。IL-2 既是自分泌細胞因子，也是旁分泌細胞因子，其通過與 T 細胞表面的 IL-2 受體 （IL-2R） 的特異性結合而促使 T 細胞活化，并進入細胞分裂狀態。

此外，IL-2 還可刺激 NK 細胞的生長并增強其殺傷能力。因此 CIK 細胞培養中須添加IL-2,以促進 T 細胞的增殖與活化。

IFN-γ （干擾素-γ）

IFN-γ 具有上調外周血淋巴細胞表面 IL-2R 表達的作用，因此會增強 T 細胞對 IL-2 促 增殖反應的敏感度和強度。在誘導 CIK 細胞形成的過程中加入 IFN- g ,可降低 IL-2 的用量。 研究發現，IFN-γ加入的順序與 CIK 的細胞毒活性密切相關。先加入 IFN- g,培養24后再 加入 IL-2,可明顯提高 CIK 的細胞毒活性。

IL-1α（白細胞介素-1α）

IL-1α也可以介導外周血淋巴細胞表面上調表達 IL-2R.當 IL-1α與 IFN-γ和激發型CD3 單抗合用時，可以明顯提高 CIK 的細胞毒作用。

【細胞制備】

1. 外周血單個核細胞的采集

1.1用血細胞分離機采集患者自身的外周血單個核細胞 80 - 100 ml。

1.2淋巴細胞分離液密度梯度離心法進一步純化單個核細胞 （PBMC）。

1.3無血清培養液洗滌 2 次，獲得純度在 90% 以上的 PBMC,細胞數量需達到 1-3 x108。

2. （可選步驟）  腫瘤抗原的制備

用于負載 DC 的腫瘤抗原可以是腫瘤特異性抗原肽 （Tumor-Specific  Antigens,  TSA）或腫瘤相關抗原 （Tumor-αssociated Antigens, TAA），也可以是腫瘤全細胞抗原。

用 TSA 或 TAA 負載的 DC 具有很好的靶向性，但該方法具有已確定的腫瘤特異性 抗原或抗原肽種類少和單一抗原的免疫攻擊經常無法殺傷腫瘤細胞等缺陷。而用腫瘤全 細胞抗原負載 DC 可克服這些缺陷，因為此時無需知道那些抗原是腫瘤細胞的 TSA 或 TAA,而且全抗原中的多種不同腫瘤抗原沖擊 DC 可誘導產生針對不同抗原決定簇的細 胞毒 T 淋巴細胞 （CTL） 克隆，從而實現對腫瘤細胞的有效殺傷。

腫瘤細胞全抗原負載 DC 的方法很多，包括用腫瘤細胞裂解液負載 DC、用凋亡腫 瘤細胞負載 DC、用壞死或死亡的腫瘤細胞負載 DC,用腫瘤活細胞負載 DC,和將腫瘤 細胞與 DC 融合等。目前臨床上常用的是用腫瘤細胞裂解液負載 DC,因該方法簡單、 快速、有效。

反復凍融是獲得腫瘤細胞裂解液的常見方法，具體步驟如下：

2.1手術切除腫瘤標本，無菌條件下，將壞死組織和癌旁非腫瘤組織去除干凈；

2.2無菌生理鹽水洗 3 次；

2.3用無菌的組織剪將腫瘤組織剪碎，加入 RPMI 1640 培養基，充分研磨；

2.4200 目無菌網過濾后收集單細胞懸液；

2.5用 RPMI 1640 培養基重懸細胞至 1-2 x 107/ml,裝入 5 ml 無菌凍存管中；

2.6將凍存管浸入液氮中速凍，10 min 后取出，再迅速放入 37oC 水浴中解凍 10 min。反復 3-5 次；注：也可以-80oC/37oC 反復凍融 3-5 次。

2.7 將腫瘤裂解物加入離心管中，3000rpm,離心 10 min；

2.8收取上清，0.22mm 濾膜過濾除菌，留樣檢測蛋白含量及細菌、真菌和支原體；2.9-80oC 保存備用。

3. CIK 細胞的培養及鑒定

3.1 步驟 1 中獲得的 PBMC 用無血清培養液調整細胞濃度至 2 x 106/ml,置于培養瓶內；

3.2 37℃，5%CO2 培養箱中孵育 2 h,以使單核細胞貼壁。

3.3 收集懸浮細胞，用無血清培養液調整細胞濃度至 1-2 x 106/ml。

3.4 加入 1,000 U/ml  的重組人 IFN-γ 培養；

3.5 24 h  后加入 50ng/ml  的 CD3  單克隆抗體和 300 U/ml  的重組人 IL-2,刺激 CIK  細 胞的生長和增殖；注：此時也可同時加入 100 U/ml 的重組人 IL-1α.

3.6 每 3 天半量換液或擴瓶一次，并補加重組人 IL-2 300 U/ml；

3.7在培養的第 7d,收獲 CIK 細胞，此時數量應達到 1x 109 個以上。

3.8 CIK 細胞質控：

3.8.1 臺盼藍染色檢測細胞活力：活細胞應在 80% 以上；3.8.2 用流式細胞儀檢測細胞表面  CD3、CD8  和 CD56  等分子的表達 ,觀察CD3+CD56+細胞的比例是否明顯提高。

4. DC 細胞的培養及鑒定

4.1 步驟 3.2 中剩下的貼壁細胞 （主要是 CD14+的單核細胞），加入含重組人 GM-CSF500-1,000U/ml 和重組人 IL-4 500U/ml 的無血清培養液，37℃，5%CO2 培養箱中 培養，誘導單核細胞向 DC 細胞分化。

4.2 每 3d 半量換液一次，并補足細胞因子；

4.3（可選步驟） 在培養的第 5d, 加入步驟 2 中獲得的腫瘤抗原 50 mg/ml,對 DC 進 行抗原負載；注：若不對 DC 進行抗原負載，該步省略。

4.4 在培養的第 6d,加入重組人 TNF-α（500U/ml），誘導 DC 細胞成熟。

4.5在培養的第 7d 或第 8d,收獲 DC  細胞，其數量應達到 1×106  個以上。

4.6DC 的質檢：

4.6.1 臺盼藍染色檢測細胞活力：活細胞應在 80% 以上；

4.6.2 流式細胞儀檢測 DC 細胞表面 HLA-DR、CD83 和 CD86 等分子的表達，以 確定 DC 是否成熟。

5. DC-CIK 細胞的制備和質檢

5.1 收集步驟 4 和步驟 3 中所獲得的 DC 細胞和 CIK 細胞，按 1∶10 （數目比） 的比例共培養，無血清培養液中添加重組人 IL-2 （300 U/ml）。

5.2每 3 天半量換液一次，并補加重組人 IL-2 （300U/ml）。

5.3 在第 7d  收集細胞，細胞數量應達到 1×1010 個以上。

5.4 DC-CIK 細胞的質檢：

5.4.1 臺盼藍染色檢測：活細胞應在 80% 以上；

5.4.2 流式細胞儀檢測細胞表面 CD3、CD8、CD56 等分子的表達：CD3+CD56+細 胞的比例應在 20% 以上。

5.4.3 細胞殺傷實驗：以 DC-CIK 細胞為效應細胞，以腫瘤細胞 （可為原代腫瘤細 胞或腫瘤細胞株） 為靶細胞，將效應細胞與靶細胞按 10 : 1（數目比）  的比例加 入 96 孔 U 型板中，每孔含靶細胞 1 x 104 個，終體積為 200 ml，設 3 個復 孔。培養 4 h，然后取培養上清，用乳酸脫氫酶 （LDH） 試劑盒檢測效應細胞 對靶細胞的殺傷率。

5.4.4 收獲細胞前，取少量培養物進行細菌、真菌培養，并檢測支原體、衣原體， 及內毒素 （標準：病原學檢測陰性，內毒素<5 Eu）。

【步驟簡圖】

【推薦試劑】

注：Animal Free 意為無動物成分。無動物成分的重組細胞因子在生產過程中不會有任何動物源性物質，尤其是牛蛋白的混入，使得最終獲得的重組人蛋白中不含任何動物成分。這樣可避免動物病原體 （如瘋牛病，克雅氏病等） 的污染 及外源蛋白引起的機體異種排斥和過敏反應，因此細胞治療的體外細胞培養過程中最好使用無動物成分的重組細胞 因子。

【其它相關試劑】

 

【參考文獻】

[1] Steinman RM, Cohn ZA. “Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution”. J. Exp. Med. 1973; 137 （5）：1142–62.

[2]  張志偉，宋鑫。DC-CIK 細胞臨床制備規范化研究。中國腫瘤，2011;20（2）：85-88.

[3] Li R, Wang C, et al. Autologous cytokine-induced killer cell immunotherapy in lung cancer:a phase II clinical study. Cancer Immunol Immunother. 2012; 61:2125–2133