——藍白克隆篩選

 

在分子克隆過程中，篩選含有插入基因片段的重組質粒轉化子是一項必不可少的工作。一種稱為“藍白斑篩選”的顏色報告基因可以根據(jù)克隆顏色快速區(qū)分出重組和非重組的克隆。盡管藍白篩選提供了一個直觀的辨別重組克隆的方法，但是，在克隆挑取過程中，過多的人工操作過程存在主觀、速度慢、易出錯等問題。

 

Molecular Devices QPix400系列微生物克隆篩選系統(tǒng)提供了一個自動化的解決方案，尤其針對藍白克隆篩選，通過白光成像提供了準確高效的克隆轉化檢測方法。這個解決方案整合了QPix Software2.0藍白篩選模塊、QPix顏色濾片以及可調平板適配器。

本文重點描述了使用QPix420系統(tǒng)進行顏色克隆篩選實驗的結果，通過DNA測序進一步驗證了挑取克隆的準確性。

 

· 通過白光高效監(jiān)控轉化效率

· 準確區(qū)分白色、藍色或淺藍色等顏色

·  智能化軟件選擇模塊，可以自動或自定義篩選

 

藍白克隆篩選的分子機理依賴于LacZ報告基因，非重組的克隆具有一個編碼B-半乳糖苷酶的功能LacZ基因。該酶分子聯(lián)合宿主菌體表達的互補片段，可以將培養(yǎng)基中的X-gal轉化為深藍色的5-溴-4-靛藍。相反，成功插入外源片段的重組質粒，LacZ基因失活，克隆顏色變?yōu)榘咨?Figure 1所示)。

 

 

 

 

Figure 1. 經典藍白克隆篩選流程示意圖：藍白篩選細菌克隆過程包括將外源基因片段插入到一個含有抗性和LacZ基因的質粒載體；插入位點為質粒載體上LacZ基因內部的多克隆位點；轉化感受態(tài)E.coli，菌體、載體以及培養(yǎng)基中的X-gal聯(lián)合作用形成藍色或白色克隆。

 

使用分子克隆方法構建重組載體克隆

作為實驗模型，人胰島素樣生長因子(IGF)基因被克隆到pUC57-Kan載體的多克隆位點(Figure 2A)。然后，將載體和基因片段(Human IGF)連接產物轉化E . coli 化學感受態(tài)(One Shot® TOP10, Life Technologies)。最后將轉化的細菌涂布到含有卡那霉素、IPTG和X-gal的LB平板，37度過夜培養(yǎng)。含有載體和插入片段或沒有插入片段的克隆，分別顯示為白色和藍色克隆(Figure 2B)。

 

 

生長好的藍白克隆平板放入可調平板適配器，然后一起放置到機器成像平臺上，平板和適配器下面為QPix顏色濾片(Figure 3A)；可調適配器上的彈性插銷，可以壓緊培養(yǎng)皿平板，確保成像過程中不會移位(Figure 3B)；QPix420白光下對平板成像(Figure 3C)。

 

 

自動識別藍白克隆

QPix420系統(tǒng)白光成像的圖片通過QPix software2.0軟件分析后，藍色(Figure 4A)或者白色(Figure 4B)克隆可以被自動識別，通過軟件內置的自動選取模塊可以分別被挑取(Figure 4C)。用戶可以通過柱狀圖調整篩選閾值以及定義不同篩選參數(shù)，如邊緣形狀、軸比、直徑及距離等，手動更改獲得最佳篩選效果。軟件選取的藍色和白色克隆， 可以通過QPix420系統(tǒng)內置的96挑針挑頭自動化挑取。

 

 

DNA測序驗證挑取的克隆

藍色和白色克隆的識別和挑取準確性通過DNA測序進行驗證。通過測序證明98%的挑取到的白色克隆在載體pUC57-Kan中都含有人IGF基因插入片段。此外，100%的挑取的藍色克隆都含有空的pUC57-Kan載體，沒有插入基因片段。通過上面實驗結果可以證明QPix400系列微生物克隆篩選系統(tǒng)能夠準確區(qū)分藍白克隆顏色，并準確挑取，是一個可靠的藍白克隆篩選方法。

藍白克隆篩選是一個通過顏色區(qū)分來快速識別是否含有插入序列重組克隆的直觀方法。Molecular Devices提供了一個自動化的藍白克隆篩選方案。QPix400微生物克隆篩選系條通過QPix software2.0友好的用戶界面配合顏色濾片，能夠在白光下即可準確區(qū)分克隆顏色。QPix400系統(tǒng)已經成為一個高效可靠的替代傳統(tǒng)人工篩選克隆的自動化平臺。