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TA克隆常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案

瀏覽次數(shù):4156 發(fā)布日期:2014-9-8  來(lái)源:本站 僅供參考,謝絕轉(zhuǎn)載,否則責(zé)任自負(fù)
TA克隆方法(Original TA Cloning Kit)把PCR片斷與一個(gè)具有3-T突出的載體DNA連接起來(lái)的方法。因?yàn)镻CR反應(yīng)中所適用的聚合酶具有末端轉(zhuǎn)移的活性,通常在3加上A。例如:Taq聚合酶同時(shí)具有的末端連接酶的功能,PCR反應(yīng)時(shí)在每條PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的3端自動(dòng)添加一個(gè)3-A突出端。只有用經(jīng)過(guò)特殊處理的具有3-T突出末端的DNA片斷才能通過(guò)T/A配對(duì)進(jìn)行連接。通過(guò)PCR的方法擴(kuò)增目的基因片斷的過(guò)程中,由于往往不清楚目的基因的DNA序列,獲得的目的片斷通常需要通過(guò)TA克隆的方法,重組到T-載體中,通過(guò)序列測(cè)定清楚DNA序列。
 
由于在PCR過(guò)程中,使用的DNA聚合酶不同,往往分為2種情況:(1)使用不同的Taq酶,在PCR擴(kuò)增循環(huán)結(jié)束后,加上72℃ 10分鐘一個(gè)過(guò)程,Taq酶可以在擴(kuò)增產(chǎn)物的3末端加上A,因此PCR產(chǎn)物回收純化后可以和T載體直接連接。(2)使用高保真的DNA聚合酶,如pfu酶,由于其不能在擴(kuò)增產(chǎn)物的3末端加上A,得到的DNA序列為鈍端,因此,需要在回收純化后進(jìn)行加A的過(guò)程,通常是以PCR回收產(chǎn)物為模板,加上一定量的普通Taq酶和反應(yīng)液,加入dATP(或dNTP), 72℃ 10分鐘,然后將加A產(chǎn)物直接用于TA連接。
 
TA克隆常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案
 
發(fā)布者:北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司
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