黃酒是中國的民族特產，也稱為米酒（ricewine），在世界三大釀造酒（黃酒、葡萄酒和啤酒）中占有重要的一席。釀酒技術獨樹一幟，成為東方釀造界的典型代表和楷模。近年來，有研究發現黃酒在發酵過程中不可避免會產生圓弧偶氮酸，這就要求必須對圓弧偶氮酸進行檢驗。

 

圓弧偶氮酸（Cyclopiazonic acid ,CPA）是曲霉屬和青霉屬的圓弧青霉的代謝產物，別名環匹阿尼酸。CPA是一種神經毒，可造成肝臟、腎臟和胃腸道損傷，體重下降、虛弱，出現食欲不振、腹瀉、脫水、精神沉郁、角弓反張、抽搐等癥狀，能影響鈣的吸收，降低蛋殼質量，影響種禽孵化，可在肉蛋奶中有殘留。據報道，有人從食品和飼料中分離出大量青霉菌，從中鑒定出數十種真菌毒素，而其中最多的就是CPA。它廣泛存在花生、大豆等糧食作物中，往往與黃曲霉毒素同時存在，因此CPA的中毒往往被黃曲霉毒素中毒所掩蓋。

 

目前環匹阿尼酸的檢測方法包括：薄層色譜法（TLC）、高效液相色譜法（HPLC）等。其中，Zambonin、李業鵬等人用50μm CW/TPR作為萃取纖維,以HPLC-UV/DAD為分離檢測手段,分別分析測定了奶酪中的圓弧偶氮酸,該方法的檢測限為7ng/mL。但是相關的檢測圓弧偶氮酸的國家標準尚未制定，也沒有針對黃酒的圓弧偶氮酸檢測的解決方案，為此普瑞邦推出了專門用于凈化濃縮圓弧偶氮酸的多功能凈化柱。該快速凈化柱，是利用多機能吸附填料吸附取出霉菌毒素檢測中的干擾峰的一類固相親和柱，適用于HPLC液相檢測谷物類、豆類、花生堅果類和黃酒中的圓弧偶氮酸的樣品凈化，凈化步驟簡單快捷，回收率高。

 

 

1. 所需設備和耗材　　

 

高效液相色譜儀及色譜柱：真菌毒素專用色譜柱（PRC-18，Pribolab）。

多功能凈化柱：PriboFast^® 230 環匹阿尼酸多功能凈化柱(M2300，5ml，25支/盒，Pribolab)。

高速均質器：達到22000rpm 以上(EQ-WR-1L，Pribolab)。

玻璃纖維濾紙：PriboFast^®玻璃纖維濾紙（GMF-110，Pribolab）

標準品：圓弧偶氮酸/環匹阿尼酸（STD#8022，Pribolab）

 

 

2.1、量取25毫升黃酒，置入250毫升均質器或250毫升錐形瓶中。依次加入70毫升甲醇和10毫升6%的碳酸氫鈉水。高速攪拌2分鐘（均質器）或在搖床上搖動1小時。

2.2、將萃取液通過Whatman 4號濾紙或者玻璃纖維濾紙，然后，吸取50毫升的濾液到250毫升的分液漏斗中。加入100毫升己烷（脫脂提取物）輕輕混合避免乳化。

2.3、在兩層分離后，小心將另一個分液漏斗收集水液層下的液體，添加50毫升的10%氯化鉀水溶液。棄掉正己烷。以2毫升6N鹽酸酸化后，加入氯仿50毫升，輕輕地混合，用250毫升的錐形瓶收集下面的有機層。

2.4、加入的50毫升氯仿采用重復方法提取，合并兩次的氯仿提取物于錐形瓶內。添加50克無水硫酸鈉鹽（硫酸鈉），靜置1小時。

2.5、過濾萃取液并全部收集到200毫升的旋轉蒸發瓶中,40ºC下蒸干。

 

 

3.1、凈化柱活化：將PriboFast 230 環匹阿尼酸多功能凈化柱以15毫升氯仿過柱，控制最大流速在3毫升/分鐘，不要讓柱干涸。

3.2、富集：用10毫升氯仿溶解旋轉蒸發器瓶中干燥后的提取物，在最大流速2毫升/分鐘條件下過柱。

3.3、洗滌：不要讓柱干涸。至全部溶液過柱后，開始洗滌柱子。以10毫升氯仿：丙酮（1 + 1）和10毫升氯仿：甲醇（95 + 5）從頂端洗柱后，以10毫升乙醚繼續洗滌。丟棄洗滌溶液。

3.4、洗脫CPA：用10毫升氯仿:甲醇（75:25）過柱洗脫，控制最大流量為2毫升/分鐘，使用合適的容器收集洗脫液（例如，20毫升的錐形試管，優選烷化硅）。

3.5、吹干：氮氣或在真空40℃水浴中干燥蒸發洗脫液。

3.6、復溶：用1毫升的流動相溶解殘渣。采用渦流混合30秒和超聲波溶解標本。

 

 

4.1、CPA貯存溶液：100μg/ml溶于甲醇。

4.2、工作標準：吸取100μL濃度為100μg/mlCPA標準溶液（10μgCPA）至琥珀色自動采樣瓶中，溶解于0.9毫升的流動相中。相對應的濃度是10μg/ml。