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分子克隆的常用載體介紹

瀏覽次數(shù):1182 發(fā)布日期:2013-10-12  來源:本站 僅供參考,謝絕轉(zhuǎn)載,否則責任自負
DNA片段的克隆需要合適的載體,載體或是質(zhì)粒,或是噬菌體,或是病毒,通常大多經(jīng)過人工改造[地的。作為載體必須具備兩條件:一是該載體在細胞內(nèi)必須能自主復(fù)制,即必須具備復(fù)制原點;二是該載體必須具備適合的酶切位點,且這些酶切位點不在復(fù)制原點區(qū)域內(nèi)。以上兩條,保證了載體的可繁殖性和可利用性。為了便于獲得陽隆克隆,載體上常有篩選標記,如對抗菌素的抗性,某些基因產(chǎn)物的顯色反應(yīng)等。
 
一、質(zhì)粒
常用的有pBR322,pUC系列質(zhì)粒等。

(一)pBR322質(zhì)粒是4362bp的環(huán)狀雙鏈DNA載體,有2個抗藥性基因(四環(huán)素和氨芐青霉素),一個復(fù)制起始點和多個用于克隆 的限制酶切點。當缺失抗藥性基因的大腸桿菌被pBR322成功地轉(zhuǎn)化時,它便從該質(zhì)粒獲得了抗生素抗性。兩個抗生素基因中均含供插入外源DNA用的不同的單一酶切位點。一般只選一個抗生素基因作為插入外源DNA之用。外源DNA插入后該抗生素抗性失活。另一抗生素抗性基因則作為轉(zhuǎn)化細菌后篩選陽性克隆 之用。

(二)pUC系列質(zhì)粒是2.7Kb的雙鏈DNA質(zhì)粒,有一個復(fù)制起點,一個氨芐青霉素抗性基因和一個多克隆位點,多克隆位點處于表達LacZ基因產(chǎn)物-β-半乳糖苷酶的氨基端片段,用pUC質(zhì)粒轉(zhuǎn)化LacZ基因有突變的大腸桿菌株(M15)時,因為由質(zhì)粒表達的α-肽補充了大腸桿菌卻失的α-肽,所以恢復(fù)了分解半乳糖的能力。在加入IPTG和X-gal的培養(yǎng)基上,長出藍色克隆。如果在多克隆位點內(nèi)插入外源DNA,由于它破壞了α-肽的表達,因而在加入IPTG和X-gal的培養(yǎng)基,不能長出藍色克隆,這就是所謂的藍白篩選。

二、單鏈絲狀噬菌體和噬粒

(一)大腸桿菌絲狀噬菌體包括M13噬菌體f噬菌體等,其基因組 均是單鏈閉環(huán)DNA分子,其中M13mp系列克隆載體是對野生型M13加以改造,插入了多克隆位點和LacZ基因后的載體,所以也是可以利用IPTG和X-gal作藍白篩選的,M13感染大腸桿菌后,即在菌體內(nèi)酶的作用下,以感染性單鏈DNA(正鏈)為模板,轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈DNA,稱作復(fù)制型DNA(RF DNA)。一般當每一個細胞內(nèi)有100-200個RF DNA拷貝時,即停止復(fù)制,產(chǎn)生有感染性的完整的單鏈絲狀噬菌體并分泌離開菌體。感染M13的大腸桿菌可繼續(xù)生長,并不發(fā)生裂解,但生長速度則較正常菌慢,取感染M13的細菌培養(yǎng)液離心,即可從菌體中提取RF DNA,供限制酶切割等分子克隆操作之用;從離心后的上清液中,可用聚乙二醇(PEG)沉出噬菌體顆粒,提取單鏈DNA(ss DNA)供DNA序列分析,體外定位突變等使用。

(二)噬粒(phagemid)在質(zhì)粒DNA中插入一段單鏈噬菌體的復(fù)制起始點DNA,即構(gòu)成了噬粒,如pGEM-3Zf(-)就是一種噬粒。噬粒可像一般質(zhì)粒一樣操作,但當需要制備單鏈DNA時,就需要在培養(yǎng)時加入輔助噬菌體,常用的輔助噬菌體有M13KO7和R408。培養(yǎng)好的菌液在離心除去菌體后,上清中加入PEG即可沉出含有單鏈DNA的顆粒。噬粒也常用于DNA序列分析和體外定位突變。分子克隆常用載體除了上述兩類以外,還有 噬菌體和粘粒,詳細情況可參閱有關(guān)資料。
發(fā)布者:上海北諾生物科技有限公司
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