Western Blot過程中常見的問題及可能原因分析
Western Blot過程中常見的問題及可能原因分析
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問題 |
可能原因 |
驗證或解決辦法 |
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背景高 |
膜沒有完全均勻濕透 |
使用100% 甲醇浸透膜5-10min |
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洗膜不充分 |
增加洗液體積和洗滌次數 | |
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阻斷不充分 |
增加封閉液孵育時間，或者提高溫度。選擇合適的封閉試劑（脫脂奶粉，BSA，酪蛋白等） | |
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二抗濃度過高 |
降低二抗濃度 | |
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檢測過程中膜干燥 |
保證充分的反應液，避免出現干膜現象 | |
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曝光過度 |
縮短曝光時間 | |
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抗體與阻斷蛋白有交叉反應 |
檢測抗體與阻斷蛋白的交叉反應性，選擇無交叉反應的封閉劑。洗滌液中加入Tween-20可減少交叉反應 | |
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沒有陽性條帶，或者陽性條帶比較弱 |
抗體染色不充分 |
增加抗體濃度，延長孵育時間 |
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酶失活 |
直接將酶和底物進行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內、有活性的酶聯物 | |
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標本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低 |
設置陽性對照，如果陽性對照有結果，但標本沒有則可能是標本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考慮增加標本上樣量解決靶蛋白含量低的原因。 | |
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試劑不匹配 |
一抗與組織種屬，一抗與二抗或/和底物與酶系統之間不匹配。通過設置內參照可以驗證二級檢測系統的有效性 | |
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一抗失效 |
選擇在有效期內抗體；并選擇現配現用的工作液 | |
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HRP抑制劑 |
所用溶液和容器中避免含有疊氮化鈉 | |
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膜沒有完全均勻濕透 |
使用100%甲醇浸透膜 | |
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靶蛋白分子量小于10Kd |
選擇小孔徑的膜，縮短轉移時間 | |
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甲醇濃度過高 |
過高甲醇濃度會導致蛋白質與SDS分離，從而沉淀在凝膠中，同時會使凝膠收縮或變硬，從而抑制高分子量蛋白的轉移。降低甲醇濃度或者使用乙醇或異丙醇代替 | |
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轉移時間不夠 |
對于厚的膠以及高分子量蛋白需要延長轉移時間 | |
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抗體染色不充分 |
增加抗體濃度，延長孵育時間 | |
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標本中靶蛋白含量太低 |
增加標本上樣量。 | |
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HRP抑制劑 |
所用溶液和容器中避免含有疊氮化鈉 | |
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抗體活性降低 |
選擇在有效期內的抗體，工作液現配現用，避免長時間放置 | |
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封閉過度 |
減少封閉劑的量或縮短時間；換用不同封閉劑類型 | |
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曝光時間過短 |
延長曝光時間 | |
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條帶位置不對；或有非特異性條帶
色帶） |
二抗的非特異性結合 |
增加一個對照：不加一抗，其他操作過程不變，即可驗證背景是否由二抗系統來源。選擇其他二抗（特異性更強的，只針對重鏈的） |
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一抗的特異性不夠 |
使用單克隆或者親和純化的抗體，保證抗體的特異性 | |
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蛋白降解 |
使用新鮮制備的標本，并使用蛋白酶抑制劑 | |
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二聚體或多聚體存在 |
增加蛋白質變性過程及強度 | |
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抗體濃度過高 |
降低抗體（一抗、二抗）濃度，可以減少非特異性條帶 | |
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蛋白上樣量過大 |
降低上樣量 | |
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封閉劑中有聚集體 |
使用前過濾封閉試劑 | |
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HRP耦聯二抗中有聚集體 |
過濾二抗試劑，去除聚集體 | |
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HRP含量過高 |
降低酶聯二抗的濃度 |
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